Ernte und Klärung von lentiviralen Vektoren im Labormaßstab mit Sartoclear Dynamics Laborfiltrationssystemen
Einleitung
Mit dem Aufkommen der Gen- und genmodifizierten Zelltherapie sind Viren zu wichtigen Werkzeugen in der Medizin geworden. Die Gentherapie hat ein erhebliches therapeutisches Potenzial für die Behandlung vieler erblicher und erworbener Krankheiten1, mit dreitausend klinischen Studien mit viralen Vektoren, die derzeit registriert sind, von denen etwa 10 % mit lentiviralen Vektoren durchgeführt werden2. Über zweitausend einzigartige genmodifizierte Zellprodukte befinden sich derzeit in der Entwicklung, und vier CAR-T-Therapien wurden bereits zur Behandlung von Onkologie-Indikationen zugelassen. Die vielversprechenden Aussichten der laufenden klinischen Studien zur Gen- und genmodifizierten Zelltherapie3,4 bedeuten, dass eine starke Nachfrage nach skalierbaren und kostengünstigen Methoden zur Produktion und Reinigung von viralen Vektoren besteht5.
Lentivirale Vektoren (LV) werden typischerweise durch transiente Transfektion von HEK293T-Zellen mit mehreren Vektorplasmiden produziert6,7. Das Virus wird in den Überstand freigesetzt; daher müssen die Zellen aus dem Zellkulturmedium entfernt werden. Eine der Herausforderungen in der CAR-T-Forschung ist das Fehlen einer etablierten Methode zur LV-Klärung, die als Goldstandard betrachtet wird. Ziel des Klärungsprozesses ist es, Hauptkontaminanten zu beseitigen und die Trübung der Lösung zu reduzieren, während die Virusaktivität erhalten bleibt. Die Klärung im Labormaßstab wird typischerweise durch Zentrifugation des Fermentationsmediums durchgeführt und durch anschließende Mikrofiltration des Überstands ergänzt1,8,9. Die Vereinfachung der Ernte und Klärung durch die Verwendung einer einstufigen Membranfiltration, die durch den Einsatz von Filterhilfsmitteln erreicht werden kann, würde die Effizienz der LV-Reinigung und T-Zell-Transduktion verbessern.
Um die Arbeitsabläufe der CAR-T-Forschung zu vereinfachen, bietet die Sartorius T-Cell Screening Solution eine halbautomatisierte, multiplexe Methode zur Entdeckung neuer Ziele und zur Entwicklung effizienter CAR-Konstrukte (Abbildung 1). Insbesondere wurde die Sartoclear Dynamics Lab-Serie von Filtrationsprodukten, die zur Klärung von Zellkulturmedien verwendet werden, entwickelt, um einen schnellen und effizienten Arbeitsablauf zur Ernte von viralen Vektoren zu erleichtern und basiert auf dem Prinzip der dynamischen Körperfiltration. Das Filterhilfsmittel Kieselgur (DE) besteht aus verkieselten Skelettresten von Diatomeen mit einer hochporösen Struktur10. Nach dem Upstream-Prozess wird das Kulturmedium zuerst mit einem Filterhilfsmittel gemischt und dann auf eine Filtermembran aufgetragen. DE bildet eine nahezu unverformbare, poröse Schicht, und seine hohe Porosität ermöglicht es der Flüssigkeit, um die Partikel herum zu fließen, wodurch ein Verstopfen des Filters verhindert wird11. Der Einsatz von Filterhilfsmitteln eliminiert den Zentrifugationsschritt und verkürzt die Verarbeitungszeit.
Materialien und Methoden
Der lentivirale Vektor wurde durch transiente Transfektion von HEK293T/17 SF-Zellen exprimiert, die in Suspension unter Verwendung des Einweg-Bioreaktors UniVessel 2 L (Sartorius) kultiviert wurden, mit vier Plasmiden, die die wesentlichen lentiviralen Gene kodieren, wie von Labisch et al.12 im Detail beschrieben.
Die Klärung von 50 ml LV-Kulturbrüheproben wurde unter Verwendung der Sartoclear Dynamics Lab V50 0,45 μm Polyethersulfon (PES) Version (Sartorius) durchgeführt. Das Sartoclear Dynamics Lab V50-Kit enthält Sartolab RF50 Vakuumfiltrationseinheiten, die aus einem Trichter, einem konischen 50 ml-Röhrchen und einem Schlauchanschluss für den Vakuumanschluss bestehen. Das Kit wird mit einer Auswahl an Standardmengen von 1 g DE (Sartorius, SDLV-0050-01F0-2) oder 2 g DE (Sartorius, SDLV-0050-02F0-2) für die Filtration von bis zu 50 ml geliefert. DE-Konzentrationen zwischen 5 g/l und 40 g/l Zellkulturbrühe wurden getestet. DE wurde zu 50 ml der Zellkulturbrühe hinzugefügt und gemischt, um eine homogene Suspension zu erhalten, die dann sofort durch die Filter geleitet wurde. Zusätzlich wurde die Klärung von 50 ml Zellkulturbrühe ohne DE in einem zweistufigen Verfahren mit 5-minütiger Zentrifugation bei 800 x g und anschließender Filtration durch einen Sartolab RF50 mit einer 0,45 μm PES-Membran (Sartorius, 180F01---------2) durchgeführt. Zur Bestimmung der Filterkapazität wurde die Klärung so lange durchgeführt, bis eine Filterverstopfung auftrat, und das Filtratvolumen wurde bestimmt. Die Vakuumfiltration wurde mit der Sartolab MultiStation (Sartorius, SDLC01) durchgeführt, einem speziell entwickelten Ständer, der bis zu sechs Sartolab RF50 Vakuumfiltrationseinheiten aufnehmen kann und die gleichzeitige Filtration von bis zu sechs Proben ermöglicht.
Ein Design of Experiment (DOE) Ansatz wurde durchgeführt, um die Klärungsbedingungen zu optimieren. Die DE-Konzentration wurde zwischen 5 g/l, 12,5 g/l und 20 g/l und die DE-Kontaktzeit zwischen 0 min, 10 min und 20 min variiert. Die Experimente wurden als vollständiges faktorielles Design mit vier Mittelpunktspunkten geplant und unter Verwendung der MODDE™ Software (Sartorius) ausgewertet. Analytische Parameter, die zur Bestimmung der Klärungsleistung verwendet wurden, waren folgende: Messung der Trübung mit einem Orion™ AQUAfast AQ3010 Trübungsmesser (Thermo Fisher Scientific); Gesamtkonzentration von dsDNA (Quant-iT™ PicoGreen™ Assay, Thermo Fisher Scientific); und Gesamtkonzentration von Proteinen (Pierce™ Coomassie Bradford Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific) vor (zentriertes Material) und nach der Filtration. Darüber hinaus wurde der LV-Partikeltiter durch Durchführung eines p24-ELISA (QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit, Cell Biolabs) bestimmt. Der infektiöse lentivirale Partikeltiter wurde durch Transduktion von adhärenten HEK293T-Zellen mit Virusproben und Messung der Transgenexpression (CD19-CAR-Konstrukt) durch Durchflusszytometrie mit dem iQue Screener PLUS (Sartorius) gemessen, wie bereits beschrieben12.
Ergebnisse und Diskussion
Bewertung des Einflusses der DE-Konzentration und der DE-Kontaktzeit auf die Trübung, den infektiösen Titer und die Filtrationszeit in einer DOE-Studie mit MODDE
Um den Effekt von DE auf die LV-Klärung zu untersuchen, wurden die Faktoren DE-Konzentration und Kontaktzeit mit DE für einen DOE-Ansatz ausgewählt, um den Einfluss dieser Parameter auf die Trübung, den infektiösen Titer und die Filtrationszeit zu bewerten. Die Gesamtdichte der Zellen in der Zellkulturbrühe, die für die Filtrationsläufe des DOE verwendet wurde, betrug 3,7 x 106 Zellen/ml mit einer Trübung von 382 NTU.
Abbildung 2 zeigt, dass die Antworten, die den infektiösen Titer und die Filtrationszeit umfassen, nur durch den Faktor der DE-Konzentration beeinflusst werden. Mit steigender DE-Konzentration nimmt der infektiöse Titer linear ab. Für die Filtrationszeit existiert ein quadratischer Term für die DE-Konzentration, was zu einer Reduzierung der Filtrationszeit führt, wenn die DE-Konzentration im definierten Konzentrationstestbereich zunimmt. Die Trübung wurde linear reduziert, je länger die Kontaktzeit der Probe mit DE war. Darüber hinaus nahm bei steigender DE-Konzentration die Trübung ab, wobei letzterer der Faktor mit dem größeren Effekt war.
Bewertung des Einflusses des Sartoclear Dynamics Lab V50 auf die Verarbeitungszeit
Die Handhabung des Sartoclear Dynamics Lab V50-Kits mit unterschiedlichen DE-Konzentrationen wurde mit der der Mikrofiltration des zentrifugierten Überstands unter Verwendung des Sartolab RF50 (Standard-Zweistufenmethode) verglichen. Bei der Ernte der Zellkultur betrug die Zelldichte für die Handhabungsexperimente 1,11 x 106 Zellen/mL und die Trübung 141 NTU. Die gesamte Verarbeitungszeit wurde in Vorbereitungszeit (d.h. Messung der Kulturvolumina, Entfernung des Überstands nach der Zentrifugation, Wägung von DE und Zugabe von DE zur Zellaufschlämmung), Zentrifugationszeit und Filtrationszeit unterteilt.
Während der Klärung des zentrifugierten Überstands verstopfte der erste Sartolab RF50-Filter nach etwa 25 ml. Daher war ein zweiter Sartolab RF50-Filter erforderlich, sodass die verbleibende ungefilterte Lösung auf einen zweiten Filter übertragen werden musste, was die Handhabung mühsam und kompliziert machte. Die Verwendung des Sartoclear Dynamics Lab V50 reduzierte die gesamte Vorbereitungszeit, da der Zentrifugationsschritt entfällt (Abbildung 3A). Die Verwendung des Sartoclear Dynamics Lab V50 reduzierte die Handhabungszeit um das 3,8-fache im Vergleich zur Standardmethode. Die Filtrationszeit hing von der DE-Konzentration ab; sie betrug 25 s bei 5 g/l und sank auf 13 s bei 60 g/l (Abbildung 3B).
Bewertung des Einflusses des Sartoclear Dynamics Lab V50 auf die Trübung und die Filterkapazität
Die Klärung wurde entweder mit Sartoclear Dynamics Lab V50 und 5 g/l DE oder mit der herkömmlichen zweistufigen Sartolab RF50-Methode durchgeführt, die die Zentrifugation der Zellkulturbrühe und die anschließende Filtration umfasst. Die zur Bestimmung der Filterkapazität verwendete Zellkulturbrühe mit Lentivirus hatte zum Zeitpunkt der Ernte eine Gesamtdichte von 3,7 x 106 Zellen/mL und eine Trübung von 398 NTU.
Nach Abbildung 4A führt die zweistufige Klärungsmethode, die Zentrifugation und Filtration kombiniert (Standardmethode), zu einer signifikant höheren Trübung von 43 NTU (Reduktion um 89 %), während das Sartoclear Dynamics Lab V50 die Trübung um 95 % auf 21 NTU reduzierte. Die Filterkapazitäten wurden durch Verwendung einer minimalen DE-Konzentration von 5 g/l mit Sartoclear Dynamics Lab V50 für die Klärung bestimmt. Die Filtration wurde fortgesetzt, bis eine Filterverstopfung auftrat. Die Durchführung der herkömmlichen Methode im Labormaßstab zur Zellentfernung und Klärung des Überstands führte nach nur 33 ml zu einer schnellen Filterverstopfung. Die Verwendung von 5 g/l DE als Filterhilfsmittel erhöhte das maximale Filtrationsvolumen erheblich und ermöglichte es, das maximale filtrierbare Volumen des verwendeten 50 ml-Filtrationsgeräts um mehr als das Doppelte zu überschreiten. Die Filterkapazitäten nahmen signifikant zu, wenn 5 g/l DE verwendet wurden (Abbildung 4B). Im Gegensatz dazu waren die Filterkapazitäten gering, wenn die herkömmliche Klärung durch Zentrifugation und anschließende Filtration durchgeführt wurde (15 L/m²). Wenn 5 g/l DE verwendet wurden, stiegen die Filterkapazitäten auf etwa 63 L/m². Nach der Klärung mit DE wurde festgestellt, dass der infektiöse LV-Titer typischerweise 75 % oder höher im Vergleich zu zentrifugiertem Material war.
Bewertung des Einflusses des Sartoclear Dynamics Lab V50 auf die Entfernung von Verunreinigungen
In einem separaten Experiment wurde das Potenzial des Sartoclear Dynamics Lab V50 zur Entfernung von prozessbedingten Verunreinigungen durch Quantifizierung der Entfernung von Gesamtprotein und dsDNA analysiert (Abbildung 5).
Eine DE-Konzentration von bis zu 10 g/l erhöhte die Entfernung von Protein und dsDNA, aber höhere DE-Konzentrationen zwischen 10 g/l und 40 g/l führten zu keiner weiteren Verbesserung der Verunreinigungsentfernung. Im Gegensatz dazu führte die Verwendung des Sartoclear Dynamics Lab V50 zu einer signifikant höheren Entfernung von Verunreinigungen im Vergleich zur Standardmethode der zweistufigen Zentrifugation und Filtration.
Fazit
Die Filtrationssysteme Sartoclear Dynamics Lab ermöglichen die Klärung von LV-haltigen Säugetierzellkulturen ohne die Notwendigkeit einer Zentrifugation. Im Vergleich zur Standardmethode führte das Sartoclear Dynamics Lab V50 zu einer besseren Reduzierung der Trübung, einer größeren Entfernung von Verunreinigungen und einer höheren Membrankapazität. Dies unterstreicht die Eignung der Filtrationssysteme Sartoclear Dynamics™ Lab für die Ernte und Klärung von lentiviralen Vektoren. Die DE-Konzentration muss jedoch angepasst werden, um hohe Ausbeuten von LV zurückzugewinnen und einen Ertragsverlust aufgrund einer unangemessen hohen DE-Menge zu vermeiden. Das Sartoclear Dynamics Lab V50-Kit mit DE ermöglicht es dem Labortechniker, eine einstufige Klärfiltration durchzuführen, die nicht nur eine schnellere und sicherere Handhabung erleichtert, sondern auch die Menge der verwendeten Labormaterialien reduziert. Das Kit ermöglicht die Auswahl einer optimierten DE-Menge, die die Filterkapazität erheblich erhöht und somit einen effizienten und robusten Lentivirus-Klärungsprozess in der Gen- und genmodifizierten Zelltherapie gewährleistet.
Referenzen
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12 Labisch, J. J., Bollmann, F., Wolff, M. W., and Pflanz, K. 2021. A new simplified clarification approach for lentiviral vectors using diatomaceous earth improves throughput and safe handling. Journal of biotechnology, 326, 11–20.
Abkürzungen
CAR - Chimerischer Antigenrezeptor
(ds)DNA - (Doppelsträngige) Desoxyribonukleinsäure
DE - Kieselgur
DOE - Versuchsplanung
HEK - Menschliche embryonale Nierenzellen
LV - Lentiviraler Vektor
PES - Polyethersulfon
TU - Transduktionseinheiten
VP - Virale Partikel
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