Forschung an hochpathogenen Viren unter Verwendung von Viruspseudotypen
Einleitung
Neue Viren, sogenannte neu auftretende Viren, stellen eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar, deren Ausmaß nicht unterschätzt werden sollte. Diese Viren haben die Fähigkeit erworben, Menschen entweder durch interspezifische Übertragung oder durch natürlich vorkommende Veränderungen im viralen Genom zu infizieren1. Infektionen, die durch neu auftretende Viren verursacht werden, führen oft zu schweren Krankheiten oder sogar zum Tod, da das menschliche Immunsystem möglicherweise nicht in der Lage ist, ein unbekanntes Virus zu bekämpfen, insbesondere wenn es zoonotischen Ursprungs ist (siehe Literatur für weiterführende Lektüre2). Verschiedene Faktoren fördern das Auftreten und die Verbreitung neu auftretender Viren3. Dazu gehören ökologische Faktoren wie die Abholzung zur Gewinnung neuer Entwicklungsflächen sowie unser Lebensstil mit globaler Mobilität und internationalem Handel. Der Verlust von Lebensräumen erhöht somit die Wahrscheinlichkeit, dass Menschen, Haustiere und Nutztiere mit Wildtierarten in Kontakt kommen, die ursprünglich isolierte Gebiete bewohnen und daher nicht als natürliche Wirte neu auftretender Viren bekannt waren. Darüber hinaus ermöglichen die Umstände einer globalisierten Gesellschaft mit zunehmendem Reiseverkehr die Verbreitung pathogener Viren auf der ganzen Welt, noch bevor klinische Symptome auftreten.
In den letzten 100 Jahren gab es mehrfach Einführungen neu auftretender Viren in die menschliche Bevölkerung, die zu lokalen Epidemien oder weltweiten Ausbrüchen (Pandemien; siehe Tabelle 1) geführt haben. Insbesondere das Ebola-Virus hat kürzlich weltweit Besorgnis erregt, da die Ebola-Epidemie in Westafrika, die mehr als 11.000 Menschenleben forderte, eindringlich die Gefahr aufzeigte, die von neu auftretenden Viren ausgeht4. Die Forschung zu neu auftretenden Viren ist oft auf Hochsicherheitslabors der Biosicherheitsstufen (BSL) 3 und 4 beschränkt (siehe Tabelle 1). Die Arbeit in BSL-4-Laboratorien ist äußerst arbeitsintensiv, teuer und nur an wenigen Standorten erlaubt, sodass schnelle wissenschaftliche Fortschritte bei der Charakterisierung viraler Krankheitserreger und der Entwicklung antiviraler Medikamente schwer zu erreichen sind.
Angesichts dieser Situation bieten Virus-Pseudotypen eine attraktive Möglichkeit, das Eindringen hochpathogener Viren in Zellen sicher und effizient zu untersuchen. Dies ist möglich, da nicht der gesamte Erreger analysiert wird, sondern nur seine Komponenten, die den Eintritt in die Wirtszelle vermitteln, die Hüllproteine. Diese stellen den Schlüssel zum Eintritt des Virus in die Zellen dar. Im Falle von Virus-Pseudotypen werden Hüllproteine hochpathogener Viren in ein Trägervirus eingebaut (Pseudotypisierung), das sich nicht autonom replizieren kann, d.h. es ist replikationsdefizient. Häufig verwendete Systeme für die Pseudotypisierung basieren auf Rhabdoviren (z.B. Vesikuläres Stomatitisvirus, VSV; Abb. 1) und Retroviren.
Ziel dieser Studie war es zu überprüfen, ob der durch Hüllproteine vermittelte Eintritt von Virus-Pseudotypen den Eintritt intakter Viren in Wirtszellen widerspiegelt. Darüber hinaus sollte diese Untersuchung klären, welchen Einfluss der Reinheitsgrad der verwendeten Reagenzien, in diesem Fall des Laborwassers, auf die Produktion von Virus-Pseudotypen hat.
Materialien und Methoden
Zellkultur, Expressionsplasmide und Transfektion: HEK-293T-, MDCKII- und Vero E6-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) inkubiert, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) und 1 % Penicillin/Streptomycin-Lösung bei 37 °C und 5 % CO₂ ergänzt war. Zum Passagieren und Aussäen wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und durch Inkubation mit Trypsin | EDTA abgelöst.
Zur Herstellung von VSV-Pseudotypen wurden Plasmide der folgenden viralen Hüllproteine als Expressionsvektoren verwendet: VSV-Glykoprotein (VSV G), Ebola-Virus-Glykoprotein (EBOV GP), Spike-Glykoprotein des Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV S), Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) des Influenza-A-Virus, das für die Spanische Grippe-Pandemie verantwortlich ist, H1N1 (1918). Zusätzlich wurde ein Expressionsplasmid für Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4) verwendet. Ein leeres Expressionsplasmid diente als Kontrolle. HEK-293T-Zellen wurden unter Verwendung von Calcium | Phosphat-Präzipitation transfiziert, wobei alle Puffer und Lösungen entweder mit demineralisiertem Wasser oder mit Sartorius Arium Pro VF-Ultrapure-Wasser hergestellt wurden.
Herstellung von Ultrapure-Wasser
Das verwendete Arium Pro VF-Ultrapure-Wasser wurde wie von Nitzki und Herbig (2013)5 beschrieben hergestellt. Dieses Wasser hat einen TOC-Gehalt (Gesamtorganischer Kohlenstoff, d.h. organisch gebundener Kohlenstoff) von weniger als 2 ppb und eine Leitfähigkeit von 0,055 μS/cm (entspricht einem Widerstand von 18,2 MΩ × cm), kompensiert auf 25 °C.
Herstellung von VSV-Pseudotypen
Zur Erzeugung von VSV-Pseudotypen wurde ein replikationsdefizienter VSV-Vektor verwendet, bei dem die genomische Information für das VSV-Glykoprotein, VSV G, durch zwei Reportergene ersetzt wurde, d.h. offene Leserahmen (ORFs), die für das grün fluoreszierende Protein (GFP) und die Glühwürmchen-Luciferase (fLUC) kodieren. Um dieses Virus (VSV*ΔG-fLUC) zu propagieren, muss das VSV G in trans bereitgestellt werden (z.B. durch Transfektion eines Expressionsplasmids). VSV-Pseudotypen wurden wie in Hoffmann et al. (2016)6 beschrieben hergestellt.
Vorbehandlung von Zielzellen mit Sialidase oder Inhibitoren:
MDCKII-Zellen wurden mit 200 mU rekombinanter Sialidase behandelt, um terminale Sialinsäuren von Glycoproteinen und Glycolipiden der Plasmamembran zu entfernen. Um zu testen, ob die durch Hüllproteine vermittelte Aufnahme von VSV-Pseudotypen in Zellen von einem sauren pH-Wert und der Aktivität zellulärer Cysteinproteasen abhängt, wurden Vero E6-Zellen mit 50 nM Bafilomycin A1 oder 50 μM E-64d inkubiert. Die verwendeten Chemikalien wurden im Zellkulturmedium verdünnt; die Inkubation erfolgte für 2 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂. Unbehandelte Zellen dienten als Kontrollen.
Analyse des durch Hüllproteine vermittelten Eintritts in Wirtszellen:
Zielzellen wurden für 1 Stunde mit VSV-Pseudotypen inkubiert, bevor sie mit PBS gewaschen und weiter mit Zellkulturmedium für 16–20 Stunden inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellen unter Verwendung von Luciferase-Lysepuffer lysiert, und die Luciferase-Aktivität in den Zelllysaten wurde in einem Chemiluminometer unter Verwendung kommerziell erhältlicher Testkits gemessen, um die Effizienz der Transduktion (d.h. den Eintritt von Pseudotypen in Wirtszellen) zu bewerten, die durch Hüllproteine vermittelt wird.
Ergebnisse
Es ist bekannt, dass das Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV, früher genannt human coronavirus, EMC = hCoV-EMC), an die Zelloberfläche durch die Interaktion zwischen der viralen Spike-Glykoprotein (S) und der zellulären Membranprotein Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4) bindet und somit den Eintritt in die Zelle ermöglicht7. Um zu bestätigen, ob dies auch im Kontext von VSV-Pseudotypen zutrifft, wurden Zielzellen mit einem Expressionsvektor für DPP4 oder einem leeren Expressionsplasmid (kein Rezeptor) transfiziert. Wie erwartet führte die gerichtete Expression von DPP4 zu einem signifikanten Anstieg des Eintritts von VSV-Pseudotypen in die Wirtszellen, wenn die Pseudotypen MERS-CoV S in ihrer Hülle eingebettet hatten (siehe Abb. 2A).
Influenza-A-Viren, die Erreger der Grippe, benötigen terminale Zuckerstrukturen, sogenannte Sialinsäuren, die als natürliche Modifikationen auf zellulären Membran-Glycoproteinen und Glycolipiden vorkommen, als Rezeptoren, um den Eintritt in Zielzellen zu vermitteln (siehe Literatur für weiterführende Lektüre8). Um zu untersuchen, ob die Einbettung von Influenza-A-Virus-Hüllproteinen in VSV-Pseudotypen ebenfalls zu einem sialinsäureabhängigen Zelleintritt führt, wurden VSV-Pseudotypen mit H1N1 (1918) HA/NA verwendet und die Sialinsäuren enzymatisch von den Oberflächen der Zielzellen entfernt. Wie erwartet führte die Entfernung der Sialinsäuren zu einem dramatischen Rückgang des Eintritts von VSV-Pseudotypen in die Wirtszellen, die H1N1 (1918) HA/NA in ihrer Hülle eingebettet hatten (siehe Abb. 2B). Diese Erkenntnis bestätigt, dass Virus-Pseudotypen den Eintrittsmechanismus authentischer Influenza-A-Viren in Zellen widerspiegeln.
Die Aktivierung des Ebola-Virus-Glykoproteins während des Zelleintritts ist pH-abhängig und erfordert die Aktivität von Cysteinproteasen
Das Glykoprotein des Ebola-Virus (EBOV GP) wird posttranslational modifiziert, um mehrere Oligosaccharide zu enthalten, und es wird angenommen, dass diese dichte Anhäufung von Glykanen das Virus vor der effizienten Erkennung durch das menschliche Immunsystem schützt9. Während des Eintritts in die Wirtszelle muss jedoch ein Teil des EBOV GP, der die Mehrheit der Zuckermodifikationen trägt, entfernt werden10. Diese funktionelle Aktivierung wird durch zelluläre Cysteinproteasen vermittelt11, die in endosomalen Vesikeln vorhanden sind und nur bei niedrigem endosomalen pH-Wert aktiv sind.
Im Folgenden haben wir untersucht, ob der durch EBOV GP vermittelte Eintritt von VSV-Pseudotypen ebenfalls von der Aktivität zellulärer Cysteinproteasen und einem niedrigen pH-Wert abhängt. Zu diesem Zweck wurden VSV-Pseudotypen mit in ihre Hülle eingebettetem EBOV GP produziert und anschließend verwendet, um Zielzellen zu inokulieren, die zuvor mit Bafilomycin A1 (verhindert die Ansäuerung in Endosomen durch Blockierung der Protonenpumpe) oder einem Cysteinprotease-Inhibitor (E-64d) inkubiert worden waren. Dies zeigte, dass der durch EBOV GP vermittelte Zelleintritt im Kontext von VSV-Pseudotypen ebenfalls von einem sauren Milieu (siehe Abb. 3A) und der Aktivität von Cysteinproteasen (siehe Abb. 3B) abhängt. Darüber hinaus konnten wir auch zeigen, dass die Behandlung mit E-64d den durch EBOV GP getriebenen Zelleintritt spezifisch blockiert, da der durch VSV-G vermittelte Pseudotyp unabhängig von Cysteinproteasen ist, obwohl er von einem niedrigen endosomalen pH-Wert abhängig ist.
Der Reinheitsgrad des verwendeten Laborwassers beeinflusst die Qualität der VSV-Pseudotypen
Nachdem in den vorherigen Versuchen gezeigt werden konnte, dass VSV-Pseudotypen geeignete Modelle zur Untersuchung des Zelleintritts hochpathogener Viren sind, war die nächste zu klärende Frage der besondere Einfluss, den der Reinheitsgrad des verwendeten Laborwassers auf die Qualität der VSV-Pseudotypen hat. Bei der Produktion von VSV-Pseudotypen werden verschiedene Puffer und Lösungen verwendet, die alle mit Wasser hergestellt werden. Es muss jedoch beachtet werden, dass nicht jede Art von Wasser für die Herstellung dieser Reagenzien ausreicht. Vielmehr muss die richtige Wahl des Reinheitsgrades für den Laboreinsatz getroffen werden.
Um zu untersuchen, ob die Verwendung von ultrapurem Wasser zu qualitativ hochwertigeren VSV-Pseudotypen führt, wurden in einem Parallelexperiment zwei Chargen von VSV-Pseudotypen erzeugt: Eine Charge wurde unter Verwendung von demineralisiertem Wasser aus einer zentralen Laborwasserversorgungsquelle (Leitfähigkeit von 3,7 – 4,1 μS/cm bei 19°C) als Basissolvent für alle Lösungen und Puffer hergestellt, während eine weitere Charge unter Verwendung von Lösungen und Puffern auf Basis von Arium Pro VF-Ultrapure-Wasser (Leitfähigkeit 0,055 μS/cm kompensiert auf 25°C) erzeugt wurde. EBOV GP und MERS-CoV S als Hüllproteine wurden untersucht. Nach der parallelen Produktion von VSV-Pseudotypen unter Beibehaltung identischer Inkubationsbedingungen wurden die Zielzellen inokuliert und der durch Hüllproteine vermittelte Eintritt von VSV-Pseudotypen quantifiziert.
Dieses experimentelle Setup zeigte, dass der Zelleintritt (als Parameter für den Qualitätsgrad) der VSV-Pseudotypen, die unter Verwendung von Arium Pro VF-Ultrapure-Wasser als Basissolvent für alle Puffer und Lösungen produziert wurden, signifikant höher war im Vergleich zu den Pseudotypen, bei deren Produktion demineralisiertes Wasser verwendet wurde (Abb. 4).
Diskussion
In dieser Studie wurden Virus-Pseudotypen auf der Basis eines replikationsdefizienten vesikulären Stomatitisvirus (VSV) produziert und die Hüllproteine verschiedener hochpathogener Viren untersucht. Wir zeigten, dass der Eintritt in die Wirtszelle auf identischen Rezeptormolekülen und biochemischen Prozessen basierte, wie sie für authentische Viren beschrieben sind. Darüber hinaus konnten wir nachweisen, dass die Verwendung von ultrapurem Wasser zur Produktion von VSV-Pseudotypen zu einer Optimierung dieses Prozesses führte. Zukünftige Untersuchungen sollten darauf abzielen, zu klären, worauf diese Beobachtung beruht: Ist dies auf eine erhöhte Menge produzierter VSV-Pseudotypen, einen effizienteren Zelleintritt oder auf eine verbesserte Stabilität der Pseudotypen zurückzuführen? Beispielsweise können wir spekulieren, dass das Fehlen von Salzen, Proteinasen oder Lipasen bei Verwendung von ultrapurem Wasser die Stabilität der VSV-Pseudotypen erhöht.
Abschließend lässt sich feststellen, dass Virus-Pseudotypen wichtige Werkzeuge zur Untersuchung des Zelleintritts hochpathogener Viren sind. Da diese Virus-Pseudotypen die Forschung an solchen hochpathogenen Viren nicht auf BLS-3- oder BLS-4-Labore beschränken, ermöglicht dies einer größeren Anzahl wissenschaftlicher Einrichtungen, solche Forschungen durchzuführen.
Infolgedessen kann der Zelleintritt von neu auftretenden Viren charakterisiert und geeignete Nachweisverfahren sowie antivirale Strategien (Medikamente, Impfstoffe) schneller entwickelt werden. Die Verwendung von Pseudotypen reduziert auch die erhebliche Arbeitsintensität in Hochsicherheitslabors, die Ganzkörperschutzanzüge erfordern, sowie die erheblichen Kosten und die Einschränkungen, die mit solchen Laborarbeiten verbunden sind (z.B. kein Zugang zu Geräten, die sich nicht direkt im Hochsicherheitslabor befinden). Darüber hinaus minimieren Virus-Pseudotypen im Vergleich zu authentischen, hochpathogenen Viren das Infektionsrisiko für Laborpersonal nach unbeabsichtigter Exposition, was einen erheblichen Sicherheitsaspekt darstellt.
Die Optimierung des Produktionsprozesses, beispielsweise durch die Verwendung hochreiner Reagenzien, insbesondere solcher auf Wasserbasis, kann zusätzlich dazu beitragen, die Empfindlichkeit nachfolgender Testverfahren zu verbessern, die Produktionsmengen zu steigern und somit die Produktionskosten weiter zu senken.
Referenzen
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5 Nitzki, F., Herbig, E. In situ Hybridisierung – Die Bedeutung von Reinstwasser für RNA Technologien”, GIT Labor-Fachzeitschrift 57. Jahrgang, 3; 2013 [auch auf Englisch verfügbar: In Situ Hybridization: The Importance of Ultrapure Water for RNA Technologies].
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11 Chandran, K. et al. Endosomal proteolysis of the Ebola virus glycoprotein is necessary for infection. Science 2005; 308: 1643–1645.
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