Invitrogen™ SuperScript™ Erststrang-Synthese-System für die RT-PCR

Das SuperScript™ III Erststrang-Synthesesystem für RT-PCR ist für die Synthese von Erststrang-cDNA aus aufgereinigter Poly(A)+- oder Gesamt-RNA optimiert. Das System kann mit nur 1 ng oder bis zu 5 µg Gesamt-RNA verwendet werden. Nach der Synthese kann die cDNA mit spezifischen Primern mittels PCR amplifiziert werden, ohne dass Zwischenschritte wie organische Extraktionen oder Ethanolfällungen notwendig sind. In Verbindung mit der PCR kann das System das Vorhandensein von seltenen Botschaften erkennen, um die Menge der spezifischen mRNA aus einer kleinen Anzahl von Zellen zu quantifizieren oder um spezifische cDNAs ohne Aufbau einer ganzen cDNA-Bibliothek zu klonen. Das System ist flexibel und erlaubt die Verwendung jedes PCR-Enzyms. Es lässt sich mit AccuPrime™ Taq DNA-Polymerase oder Platinum™ Taq DNA-Polymerase für höher spezifische PCR oder mit AccuPrime™ Pfx DNA-Polymerase für High-Fidelity-Klonierungsanwendungen kombinieren.

Superscript II RT
Die Erststrang-cDNA-Synthesereaktion wird durch Superscript™ II reverse Transkriptase (RT) katalysiert. Dieses speziell zu diesem Zweck entwickelte Enzym reduziert die RNase-H-Aktivität, die mRNA während der Erststrang-Reaktion abbaut. Das Ergebnis ist eine bessere Synthese von Volllängen-cDNA und eine höhere Ausbeute an Erststrang-cDNA, als mit RNase H+ RTs möglich ist. Da SuperScript™ II RT nicht signifikant von ribosomaler und Transfer-RNA gehemmt wird, kann sie für die effektive Synthetisierung von Erststrang-cDNA aus Gesamt-RNA-Präparaten verwendet werden. Das Enzym weist eine erhöhte thermische Stabilität auf und kann bei Temperaturen bis zu 50 °C verwendet werden.

Verwendung des Superscript™ Erststrang-Synthesesystems für RT-PCR
Dieses System wurde für die Synthetisierung von Erststrang-cDNA aus unterschiedlichen Mengen Ausgangsmaterial optimiert. Die SuperScript™ II RT-Konzentration wurde gesenkt und RNaseOUT™ rekombinanter RNase-Inhibitor wurde als Teil dieser Optimierung zugegeben. Durch Modifizierung der Reaktionsbedingungen wurde die Empfindlichkeit des Systems weiter erhöht. Bei Verwendung dieses Kits wird Erststrang-cDNA synthetisiert, und zwar mittels Gesamt-RNA, Poly(A)+ selektierter RNA, verbreitet mit Oligo(dT), Random-Primern oder einem genspezifischen Primer. Anschließend wird die PCR in einem separaten Röhrchen unter Anwendung von speziell für dieses Gen bereiteten Primern durchgeführt.