Ermöglichung der funktionellen Analyse der zellulären Immunologie
Unter optimalen Bedingungen ermöglicht der ELISpot-Assay (enzyme-linked immunosorbent spot) die Visualisierung mehrerer von einer einzelnen reagierenden Zelle freigesetzter Produkte. Somit liefert der ELISpot sowohl qualitative (Art des Immunproteins) als auch quantitative (Anzahl der reagierenden Zellen) Informationen. Aufgrund der unübertroffenen Empfindlichkeit dieses Assays ist die Frequenzanalyse seltener Zellpopulationen (z. B. antigenspezifische Reaktionen), die zuvor nicht möglich war, nun relativ einfach. Jüngste Verbesserungen im Design von Mehrfach-Mikroplatten, einschließlich der Verwendung von Membranen mit reduzierter Hintergrundfluoreszenz, haben die weitverbreitete Anwendung von EliSpot-Assays unterstützt.
Wenn man Empfindlichkeit, Benutzerfreundlichkeit und Kosten des Assays zusammen betrachtet, ist die EliSpot-Plattform wahrscheinlich die überlegene Wahl für die Entwicklung multifunktionaler T-Zell-Assays für Forschungs-, Therapie- und Diagnosegemeinschaften.
Die Beliebtheit dieses Assays hat in den letzten Jahren einen Aufschwung erlebt, da Forschende versuchen, ein besseres Verständnis der Immunantworten in einer Vielzahl von Anwendungen zu gewinnen, einschließlich der Untersuchung des immunologischen Gedächtnisses und der Impfstoffentwicklung.
ELISpot-Optimierung
Obwohl ELISpot-Assays die Bestimmung der Häufigkeit sehr seltener Ereignisse ermöglichen, kann die Dateninterpretation zweideutig werden, wenn die Fleckenzahlen in antigenhaltigen Wells niedrig sind, die Fleckenzahlen in negativen Kontrollwells erhöht sind und insbesondere, wenn beides gleichzeitig auftritt. Daher muss die Hauptaufgabe, noch bevor statistische Methoden angewendet werden, die Optimierung der grundlegenden Assay-Parameter und Reagenzien sein, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Während die Verwendung hochspezifischer, für ELISpot validierter Antikörperpaare entscheidend für den Erfolg des Assays ist, sind die sorgfältige Berücksichtigung und Durchführung einer Reihe weiterer Schritte erforderlich, um eine optimale Leistung sicherzustellen.
Auswahl der Platte (Membran)
PVDF-Membranplatten (Merck-Katalognummern: MSIPS4W10, MSIPS4510, MAIPSWU10, MAIPS4510) werden gegenüber dem Format aus gemischtem Celluloseester (Merck-Katalognummer: MSHAS4510) empfohlen, da sie eine etwas bessere Bindung des Fangantikörpers und eine überlegene Leistung bei der Fleckendetektion bieten, insbesondere für fluoreszierende Anwendungen. Der einzige Nachteil von PVDF-Platten ist die extreme Hydrophobizität des Materials, eine Eigenschaft, die ein Vorbenetzen mit Alkohol erfordern kann, bevor der Beschichtungsantikörper hinzugefügt wird. Da die gemischte Cellulosemembran hydrophil ist, können ELISpot-Assays ohne Vorbenetzung durchgeführt werden.
Negative/Positive Kontrollen
Relevante Kontrollen sind entscheidend für die Messung antigener spezifischer Reaktionen mittels ELISpot. Negative Kontrollen bestehen routinemäßig aus Zellen, die ohne Stimuli kultiviert werden, während polyklonale T-Zell-Aktivatoren häufig als positive Kontrollen eingesetzt werden, um sowohl die Zell- als auch die Assay-Funktionalität zu bestätigen. Zu den positiven Kontrollen gehören Anti-CD3/CD28-Antikörper, Phytohämagglutinin (PHA) und Concanavalin A (ConA). Diese Aktivatoren induzieren die Sekretion vieler gängiger Zytokine, darunter IFNγ, IL-2 (Th1), IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 (Th2).
Eine weitere häufige Kontrolle ist der kommerziell erhältliche CEF-Peptidpool (Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus, Influenzavirus). Dieser besteht aus mehreren Epitopen aus jedem der drei Viren, gegenüber denen die meisten gesunden Individuen (~90 %) CD8-reaktive T-Zellen besitzen.
Da wir in diesem Artikel nur einige Aspekte skizzieren können, möchten wir Sie auf unser ELISpot White Paper, in dem das Assay-Protokoll ausführlich und mit Schwerpunkt auf bewährte Verfahren und Fehlerbehebung behandelt wird.
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