Einleitung
Gentherapien bieten großes Potenzial für die Einführung bahnbrechender Technologien in den kommenden Jahren. Diese zielgerichteten, komplexen Therapien, die in der Regel durch die Einführung von Vektoren, die Gene enthalten, in einen Patienten wirken, haben das Potenzial, seltene und schwer behandelbare Krankheiten in verschiedenen medizinischen Bereichen zu heilen. Dennoch bleiben mehrere Herausforderungen zu bewältigen, bevor die Gentherapie ihr Potenzial voll ausschöpfen kann. Eine der wichtigsten ist die experimentelle Reproduzierbarkeit in den Forschungs- und Entdeckungsphasen, die üblicherweise in akademischen Einrichtungen stattfinden. Trotz der großen Bedeutung der Reproduzierbarkeit ist es nicht ungewöhnlich, von Wissenschaftlern zu hören, die versuchen und scheitern, die Ergebnisse anderer zu reproduzieren.
"Der Erfolg der Gentherapie hängt von der Entwicklung reproduzierbarer Daten ab."
Es gibt unzählige wissenschaftliche Ansätze und komplexe technische Verfahren in einem Prozess, und folglich kann ein experimentelles Ergebnis schwer zu replizieren sein. Alle Beteiligten an der Entwicklung und Bereitstellung von Medikamenten der nächsten Generation müssen sich auf robuste, datenbasierte Nachweise ihrer Vorteile stützen, um Entscheidungen zu unterstützen und die Überführung vielversprechender Entdeckungen in wirksame Therapeutika sicherzustellen.
Hier heben wir einige Hindernisse hervor, die mit Laborgeräten verbunden sind und die experimentelle Reproduzierbarkeit beeinträchtigen können, und geben Empfehlungen, wie diese überwunden werden können. Das Erreichen des höchstmöglichen Maßes an Einheitlichkeit bei gängigen Laborpraktiken ist unbedingt erforderlich. Das bedeutet, dass Laborwissenschaftler ausreichend geschult sein und strikt die korrekten Verfahren für Betrieb und Wartung von Laborgeräten befolgen sollten. In akademischen Forschungseinrichtungen werden diese Protokolle von Laborleitern auf Basis der Empfehlungen in den Benutzerhandbüchern der Gerätehersteller erstellt. Da es keine spezifischen Regeln gibt, können akademische Praktiken stark variieren. Thermo Fisher Scientific erkennt die Notwendigkeit, zusätzliche Unterstützung in Form einer Vielzahl umfassender Materialien bereitzustellen, einschließlich technischer Hinweise, Anwendungshinweise und Smart Notes, die jeden Aspekt der Nutzung und Wartung von Geräten abdecken. Ziel ist es, Ihnen zu ermöglichen, Ihre Geräte optimal zu nutzen und die Reproduzierbarkeit Ihrer experimentellen Daten zu erhöhen.
Verbesserung der Laborpraktiken auf Forschungsebene
Plasmidproduktion
In akademischen Einrichtungen werden Plasmide, die virale Vektoren codieren, üblicherweise in Escherichia coli-Bakterienzellen auf Orbitalshakern wie den Thermo Scientific™ Solaris™ Tischschüttlern mit Temperaturregelung. hergestellt. Wenn das Ziel darin besteht, Plasmide von hoher Qualität, in ausreichender Menge und reproduzierbar zu erzeugen, müssen einige Schlüsselfunktionen berücksichtigt werden. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Schergeschwindigkeiten von bis zu 400 U/min höhere Ausbeuten erzeugen und die Begrenzung der Mikroorganismen-Zirkulation, die den Kulturansatz potenziell kontaminieren könnten, wichtig ist, um die Integrität des Endprodukts zu gewährleisten. Ebenso sorgen Funktionen, die eine regelmäßige, einfache Reinigung erleichtern, dafür, dass keine Oberflächen Rückstände von Kontaminationen aufweisen. Darüber hinaus ist die Möglichkeit, Parameter während des Betriebs des Shakers gleichzeitig einzusehen und anzupassen, vorteilhaft für die Qualitätssicherung. Eine Smart Note¹ behandelt wichtige Überlegungen bei der Bewertung eines großen Orbitalshakers für die Produktion von Plasmid-DNA.
Suspensionen müssen je nach Kulturgefäß und Zelltyp mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und Orbits geschüttelt werden, daher ist die Wahl des richtigen Orbitalshakers für Ihre Anwendung entscheidend². Weitere kritische Punkte sind die richtige Installation des Shakers, Betrieb und Best Practices für die Zellproduktion, Reinigungs- und Desinfektionsprozesse sowie regelmäßige vorbeugende Wartung³. Thermo Fisher Scientific ist stets einen Schritt voraus und hat viel Zeit und Ressourcen investiert, um die am meisten benötigten Protokolle zu optimieren (z. B. Plasmid-DNA-Produktion in E. coli⁴), sodass Sie dies nicht tun müssen. Durch Testen und Implementieren dieser Protokolle in Ihrem Labor können Sie Effizienz und experimentelle Reproduzierbarkeit gleichzeitig steigern.
Weitere kritische Schritte bei der Plasmid-DNA-Vorbereitung sind das Pelletieren von Bakterienzellen sowie die Extraktion und Reinigung von Plasmiden. In akademischen Einrichtungen ist die Zentrifugation nach wie vor die beliebteste und kostengünstigste Methode für diese Schritte. Beispielsweise kann Plasmid-DNA in einer Cäsiumchlorid-Gradienten-Isolation gewonnen werden, wobei ein Ultrazentrifugensystem wie der Thermo Scientific™ Sorvall™ WX+ erforderlich ist und Ethidiumbromid verwendet wird. Alternativ können Schwerkraft- oder Spin-Säulen-Kits Plasmid-DNA effektiv in Superspeed- und Mikro-Zentrifugen reinigen. Zur Steigerung der Reproduzierbarkeit Ihres Protokolls können eine Thermo Scientific™ Sorvall™ LYNX 6000 Superspeed Zentrifuge und Thermo Scientific™ Fiberlite Carbon Fiber Rotors in Kombination mit kommerziellen DNA-Präparationskits verwendet werden, um Plasmid-DNA in hoher Qualität im großen Maßstab (ca. 1 mg) zu erhalten. Alternativ gibt es eine kostengünstigere Methode ohne Kit. Beide Protokolle wurden optimiert, und Empfehlungen sind leicht zugänglich in Form einer Application Note⁵.
Darüber hinaus stellt Thermo Fisher Scientific umfassende Benutzerhandbücher für alle Zentrifugenmodelle bereit, z. B. für den LYNX⁶, einschließlich Empfehlungen zur Desinfektion, Dekontamination, Autoklavierung und Wartung, die problemlos in Schritt-für-Schritt-Betriebsverfahren umgesetzt werden können. Dadurch können Sie nicht nur die Lebensdauer der Zentrifuge erhöhen, sondern auch die Erfolgsrate und Reproduzierbarkeit Ihrer Plasmid-Extraktionsverfahren steigern. Wenn Sie zudem planen, in Zukunft von Forschungsbetrieben in eine GLP-/GMP-regulierte Umgebung überzugehen, kann die Thermo Scientific™ Centri-Log™ Plus Data Management Software7 in Sorvall™ LYNX-Zentrifugen integriert werden, um eine genaue Datenerfassung und Rückverfolgbarkeit gemäß den Vorschriften von 21 CFR Part 11 für elektronische Aufzeichnungen zu gewährleisten.
Produktion von Viralen Vektoren
Die Entwicklung und Optimierung Ihrer Lentivirus-Produktionsplattform zur Erstellung robuster Transfektionsprotokolle kann sehr anspruchsvoll sein, insbesondere wenn hohe Ausbeuten, Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit Priorität haben. Alle Komponenten, einschließlich Medien, Transfektionsreagenzien, Zusätze und Zellen, müssen in perfekter Synergie arbeiten, um hochwertige und funktionelle Lentiviruspartikel zu erzeugen. Forschungsanwendungen, wie die Entwicklung neuer Gentherapien, hängen stark vom hochwertigen Zellwachstum ab. Ein anschauliches Beispiel ist die Verwendung von Adhärenz- oder Suspensionskulturen für HEK 293-Virusproduktionszellen. Werden die Zellen nicht unter optimalen Bedingungen kultiviert, werden sowohl die experimentellen Ergebnisse als auch die Reproduzierbarkeit negativ beeinflusst, oft auf schwer erkennbare Weise.
Die Qualitätsmerkmale des finalen Zellprodukts, der Viruspartikel, können je nach den in der CO2-Inkubator aufrechterhaltenen Kulturbedingungen stark variieren. Tatsächlich kann die reproduzierbare Kultivierungsleistung stark beeinflusst werden, je nachdem, welche Funktionen und Technologien im Design der CO2-Inkubatoren implementiert werden. Da Zellen auf wechselnde oder unterschiedliche Reize reagieren, ist es entscheidend, dass die Bedingungen in der Kultivierungskammer von oben nach unten und von Seite zu Seite gleichmäßig sind, sodass alle Zellen die gleichen Bedingungen erfahren. Noch wichtiger ist, dass der Inkubator nach dem Öffnen der Tür schnell wieder die gewünschten Bedingungen erreicht, sodass die Zellen die meiste Zeit in optimalen Parametern verbringen, was die Verdopplungszeit verkürzt und die Qualität unterstützt. Ideale Bedingungen für Zellgesundheit und -wachstum hängen nicht nur von der Temperatur ab, sondern auch vom CO2-Level, Sauerstofflevel und der relativen Luftfeuchtigkeit (RH), da alle eine Rolle für die Zellgesundheit spielen. Inkubatoren, die Gleichmäßigkeit und schnelle Wiederherstellung gewährleisten, wie die Thermo Scientific™ Heracell™ VIOS CO2 und Forma™ Steri-Cycle™ CO2 helfen, die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge zu erhöhen. Darüber hinaus bietet Thermo Fisher Scientific Best-Practice-Informationen zur richtigen Pflege und Wartung Ihres Zellkulturinkubators, einschließlich Empfehlungen zu Installation und Positionierung im Labor, Kontaminationsvermeidung, Desinfektionsverfahren sowie Hinweise zur Verwendung des richtigen Wassertyps. Alles mit dem Ziel, qualitativ hochwertige experimentelle Ergebnisse sicherzustellen, die Ihre Forschung vorantreiben.⁸,⁹
Wenn Sie Ihre HEK 293-Lentivirus-Produktionszellen in Suspension kultivieren, kann die Verwendung eines CO2-resistenten Orbitalshakers mit kleiner Stellfläche von Vorteil sein. Ideal für den Einsatz in einem CO2-Inkubator, verfügen diese Shaker über speziell behandelte mechanische Komponenten, die bis zu 20 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit standhalten. Im Vergleich dazu sind die meisten offenen Orbitalshaker nicht dafür ausgelegt, den sauren Bedingungen einer CO2-Kammer standzuhalten, und müssen regelmäßig ersetzt werden. Die Thermo Scientific™ CO2-Resistant Orbital Shakers sind außerdem so konstruiert, dass sie nur minimale Wärme abgeben, wodurch die Bedingungen in der CO2-Kammer nicht beeinträchtigt werden. Die richtige Wahl des Orbitalshakers für Ihre Anwendung kann seine Lebensdauer verlängern und sicherstellen, dass optimale Wachstumsbedingungen und reproduzierbare Kulturergebnisse aufrechterhalten werden.
Fazit
Es gibt viele Beispiele für Laborgeräte in der Gentherapieforschung, an die man vielleicht nicht denkt, die jedoch erhebliches Potenzial haben, die Reproduzierbarkeit Ihrer experimentellen Ergebnisse zu beeinflussen. Die wichtigste Lektion ist, mehr Aufmerksamkeit darauf zu verwenden und mehr Zeit zu investieren, um sich mit den Empfehlungen des Lieferanten vertraut zu machen, wie sie in Benutzerhandbüchern und verschiedenen technischen Hinweisen bereitgestellt werden. In experimentellen Forschungskontexten liegt der Fokus häufig hauptsächlich auf spezifischen experimentellen Protokollen, während Empfehlungen zur Geräteinstallation, korrekten Positionierung, Pflege und vorbeugenden Wartung, Kontaminationsprävention sowie Reinigung und Desinfektion vernachlässigt werden. Denken Sie daran, dass selbst Laborgeräte wie Sicherheitswerkbänke, Zentrifugen, Inkubatoren, Schüttler, Kühlschränke und Gefrierschränke mit Respekt und Sorgfalt behandelt werden müssen. Sie sollten zu einem Partner auf Ihrem Weg werden, um Ihre Experimente sowohl erfolgreicher als auch reproduzierbarer zu machen.
Referenzen
1 Thermo Scientific. Smart Note: Orbital Shakers-Which Features are Important Considerations When Evaluating a Large Orbital Shaker for Production of Plasmid DNA Encoding Viral Vectors, for Applications Including CAR-T, Gene Therapy, or Other Genetic Engineering? https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LPD/Product-Information/Orbital-Shakers-DNA-Encoding-SmartNote-SNORBSHAKERDNA-EN.pdf
2 Thermo Scientific. Application Note: Choosing the Right Orbital Shaker for Your Application. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D20064.pdf
3 Thermo Scientific. Application Note: Orbital Shaker Benchmarks-Best Practices for Use and Maintenance. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/Orbital-Shaker-Benchmarks-Best-Practices-App-Note-ANMAXQBEST.pdf
4 Thermo Scientific. Application Note: Optimization of Plasmid DNA Production in Escherichia coli Utilizing the Thermo Scientific MaxQ 8000 Incubated Stackable Shakers. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D19993~.pdf
5 Thermo Scientific. Application Note: DNA Preparation Using the Thermo Scientific Sorvall LYNX Superspeed Centrifuge Series. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Application-Notes/D21231.pdf
6 Thermo Scientific. Instruction Manual: Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000/6000 Superspeed Centrifuge. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLED%2Fmanuals%2F50136519-h-Thermo%20Scientific%20Sorvall%20LYNX-en.pdf
7 Thermo Scientific. Centri-Log Plus Software: An Accurate and Reliable Data Management Solution. https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLPD%2Fbrochures%2FCentriLog-Plus-Brochure-GLOBAL-FNL-FWR-1.pdf
8 Thermo Scientific. Technical Note: Proper Care and Maintenance for a Cell Culture Incubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Warranties/TNCO2CAREFEED-EN.pdf
9 Thermo Scientific. Smart Note: CO2 Incubators-Smart Water for Your CO2 Incubator. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/brochures/CO2-Incubator-Water-SmartNote-EN.pdf
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