Die Bioprinting-Technologie ist zusammen mit der Stammzellenforschung gewachsen und hat sich zu einem unverzichtbaren Werkzeug mit vielfältigen Anwendungen im biologischen und medizinischen Bereich entwickelt. In-vitro-3D-Zellkulturtechniken schaffen eine akkurate In-vitro-Umgebung und bieten eine Alternative zu In-vivo-Modellen, die für die zellbiologische und physiologische Grundlagenforschung verwendet werden. Allerdings werden diese Anwendungen derzeit durch die Variabilität der Organoide, den geringen Durchsatz und den begrenzten Maßstab behindert. Obwohl erwartet wird, dass die Bioprinting-Technologie in der regenerativen Medizin und der Arzneimittelforschung eingesetzt wird, gibt es anhaltende Bedenken hinsichtlich der Auswirkungen von Zelldispensern auf die Zellintegrität.
Bioprinting mit Zellsuspensionen und intestinalen Organoidfragmenten
Der Corning™ Matribot™ Bioprinter zeigte eine zellschonende Dispensierleistung, die der des manuellen Dispensierens ähnelte. Die vom Corning™ Matribot™ Bioprinter dispensierten Kulturen eigneten sich für die weitere Molekular- und Proteinanalyse sowie für nachgelagerte Anwendungen wie das Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten.
Die Corning Matrigel™-Matrix wurde aufgetaut und gemäß der Anleitung aliquotiert. Alle für die Handhabung von Sphäroiden oder Organoiden verwendeten Spitzen und Spritzen wurden vorgekühlt. Die Medien wurden vor der Verwendung auf Raumtemperatur (15°C bis 25°C) gebracht. A549- und MDCK-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, kultiviert, bis sie 90 % Konfluenz erreicht hatten.
Das Medium wurde abgesaugt, die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit 0,25 % Trypsin-EDTA in einzelne Zellen dissoziiert. Ein gleiches Volumen an vollständigem Medium wurde dann zu den Zellen gegeben und gemischt. Die Suspension wurde 3 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in unverdünnter Corning Matrigel™-Matrix resuspendiert.
Ein gleiches Volumen an komplettem Medium (DMEM + 10% FBS) wurde dann zu den Zellen gegeben und gemischt. Die Suspension wurde 3 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in unverdünnter Corning Matrigel™-Matrix resuspendiert. Die endgültige Zelldichte wurde auf 50 Zellen/μL eingestellt. Das Gemisch aus Matrigel-Matrix und Zellen wurde in eine Spritze überführt, in den Druckkopf des Corning Matribot Bioprinters eingeführt und mit den in Tabelle 1 aufgeführten Parametern dosiert. Das manuelle Dispensieren wurde mit einer Einkanalpipette durchgeführt. Die Platten wurden 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, dann wurde in jede Vertiefung 1 ml komplettes Medium gegeben. Die Platten wurden bei 37 °C und 5 % CO2 bebrütet, und das Medium wurde alle 2 bis 3 Tage gewechselt.
"Wir konnten zeigen, dass die mit dem Corning™ Matribot™ Bioprinter hergestellten 3D-Kulturen mit denen vergleichbar waren, die manuell hergestellt wurden. Beide Methoden zeigten eine ähnliche Morphologie, ähnliche Zelltypen und ein ähnliches Genexpressionsprofil."
Maus-Darm-Organoide (MIOs) wurden aufgetaut, kultiviert und in vollständigem IntestiCult™ Organoid-Wachstumsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers weitergegeben, bis eine Dichte von etwa 150 Organoiden/Well erreicht war. Mit einer angefeuchteten 1.000-μl-Pipette wurden die Organoide durch 20-maliges Auf- und Abpipettieren aufgebrochen und anschließend bei 290 x g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig verworfen, und das Pellet wurde in unverdünnter Matrigel™-Matrix durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Die Mischung aus Matrigel™-Matrix und MIO-Suspension wurde in eine Spritze überführt, in den Druckkopf des Corning Matribot-Biodruckers eingeführt und mit den in Tabelle 1 aufgeführten Parametern dosiert. Das manuelle Dispensieren wurde mit einer Einkanalpipette durchgeführt. Die Platten wurden 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, dann wurde in jede Vertiefung ein komplettes IntestiCult Organoid-Wachstumsmedium (1 ml) gegeben. Das Medium wurde dreimal pro Woche gewechselt.
Ergebnisse und Diskussion
Die Morphologie der A549-Sphäroide, die aus mit dem Bioprinter und manuell entnommenen Proben hergestellt wurden, schien normale Formen zu haben. Nach 7-tägiger Kultivierung zeigten die per Bioprinter und manuell dispensierten MDCK-Sphäroide deutliche und typische zystische Strukturen (Abbildung 1B). Komplexe, mehrlappige MIO-Strukturen wurden auch nach 5 Tagen Kulturzeit beobachtet. Außerdem waren die Dichten der gebildeten 3D-Kulturen zwischen den mit dem Bioprinter und den manuell dispensierten Proben vergleichbar (
Immunfluoreszenzfärbungen wurden durchgeführt, um das Vorhandensein spezifischer Zelltypmarker in den 3D-Kulturen zu untersuchen. An den Zell-Zell-Kontaktpunkten innerhalb der A549-Sphäroide wurde signifikantes junktionales F-Actin beobachtet, was darauf hindeutet, dass stabile und starke interzelluläre adhäsive Interaktionen gebildet wurden. Darüber hinaus zeigten die 3D-Kulturen von A549-Zellen eine helle und kontinuierliche E-Cadherin-Markierung auf der Zelloberfläche und an den Zell-Zell-Kontaktstellen. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte, dass F-Actin und E-Cadherin in den A549-Sphäroiden, die sowohl durch Bioprinting als auch durch manuelles Dispensieren erzeugt wurden, stark exprimiert wurden.
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