Isolierung genomischer DNA, Lysepuffer B3, Macherey-Nagel™

Prinzipien/Verfahren zur Aufreinigung genomischer DNA aus Vollblut
NucleoSpin™ Blut Kits sind für die schnelle Aufreinigung genomischer DNA aus Vollblut, Serum, Plasma und Körperflüssigkeiten konzipiert. Tierische oder menschliche Blutproben, frisches oder gefrorenes Material, können problemlos verarbeitet werden. Die NucleoSpin™ Blut-Methode basiert auf einer speziell behandelten Silika-Membran mit hohem Bindungsvermögen für Nukleinsäuren. Die gewonnene DNA lässt sich direkt für PCR*, (z. B. HLA-Typisierung) Southern Blotting oder beliebige Arten enzymatischer Reaktionen verwenden. Das Kit erlaubt die Isolierung von 4 μg bis 6 μg reiner genomischer DNA aus 200 μl Vollblut mit einem A_260/280 Verhältnis zwischen 1.60 und 1.90; typische Konzentration von 40 ng/μl bis 60ng/μl. Aufgrund des hohen Bindungsvermögens der NucleoSpin™ Blut-Membran sind Ausbeuten von bis zu 60 μg möglich (von Ausgangsmaterialien wie Buffy-Coat oder mit Lymphozyten angereicherte Proben). Mit der NucleoSpin™ Blut-Methode wird genomische DNA aus Vollblut gewonnen. Die Gewinnung der Lyse erfolgt durch Inkubation von Vollblut bei 70 °C in einer Lösung, die große Mengen chaotroper Ionen in Gegenwart von Proteinase K enthält. Durch Zugabe von Ethanol werden geeignete Bedingungen für die Bindung von DNA an die Silika-Membran der NucleoSpin™ Blut-Säulen zum Lysat geschaffen. Der Bindungsprozess ist reversibel und Nukleinsäure-spezifisch. Kontaminationen werden durch Waschen mit zwei verschiedenen Puffern entfernt. Schließlich wird reine genomische DNA unter Bedingungen niedriger Ionenstärke in einem leicht alkalischen Elutionspuffer eluiert. Die für die Herstellung genomischer DNA aus Blut mittels NucleoSpin™ Blut benötigte Zeit beträgt weniger als 30 Minuten.
Prinzipien/Verfahren für die Aufreinigung viraler DNA aus Blut und biologischen Flüssigkeiten
Die hochempfindlichen NucleoSpin™ Blut-Kits sind für die Gewinnung von viralen Nukleinsäuren aus Serum, Plasma oder Blut vorgesehen. Mit den wachsenden Anforderungen der klinischen Diagnostik kommt der Isolierung viraler DNA – insbesondere von Hepatitis B (HBV) – aus Serum und Plasma eine immer höhere Bedeutung zu. Die Extraktion von HBV-DNA ist aufgrund der speziellen Genomorganisation des Hepatitis-B-Virus anspruchsvoll. Vor der Bindung der Nukleinsäure an die Silika-Membran muss ein Terminus-Protein, kovalent an einen der HBV-DNA-Stränge gebunden, entfernt werden. Die NucleoSpin™ Blut-Methode umfasst einen Proteinase K-Schritt für den Verdau von Proteinen. Anschließend wird die virale DNA an die Silika-Membran gebunden und zweimal mit zwei verschiedenen Puffern gewaschen, damit die Entfernung von Kontaminationen gewährleistet ist. Die Elution kann mit Wasser oder Salzpuffer durchgeführt werden. Inhalt des Kits: NucleoSpin™ Blut-Säulen, 2 ml-Entnahmeröhrchen, Puffer, Proteinase K.

• Vorbereitungszeit: 30min/Aufbereitung
• Silika-Membran-Technologie
• Format: Mini-Spin-Säulen
• Vollständige Beseitigung von PCR*-Inhibitoren
• Probengröße: bis zu 200 μl/5 x 10⁶ Zellen
• Typische Ausbeute: 4 μg bis 6 μg DNA
• Elutionsvolumen: 100 μ l
• Bindungsvermögen: ≤60μ g
• Keine Verwendung organischer Lösungsmittel
• Auch für die Isolierung viraler DNA geeignet: HBV, CMV, HPV und EBV, Extraktion aus: Vollblut (menschliches oder tierisches Blut), mit Citrat EDTA, Heparin CPDA behandeltes Vollblut, Serum, Plasma, Buffy-Coat, Thrombozyten, Körperflüssigkeiten (z. B. Fruchtwasser); bis zu 10⁷ Lymphozyten, Kulturzellen. Isolierung von viralen Nukleinsäuren – HBV; CMV; HPV; EBV.