Thermo Scientific™ ActivX™ Desthiobiotin-GTP-Sonde

ActivX™ Desthiobiotin-GTP-Sonden enthalten ein modifiziertes Biotin, das durch eine labile Acylphosphat-Bindung an das Nukleotid gebunden ist. ActivX Anreicherungs-Sonden für aktive Zentren sind vorteilhaft für die Bestimmung des aktiven Enzymspiegels durch den Einsatz von Analogon-markierten Sonden, um sowohl inaktive als auch aktive Enzyme profilieren zu können. Die ActivX Sonden reichern selektiv nur jene Enzyme an, die zum Zeitpunkt der Markierung funktionell aktiv und biologisch relevant sind. Mit der selektiven Anreicherung kann man Zielenzymklassen in Proben identifizieren und profilieren oder die Spezifität und Affinität von Enzym-Inhibitoren beurteilen.

Nach der Entfernung von GTP- oder GDP-Nukleotiden aus Enzymen kann die Desthiobiotin-GTP-Sonde verwendet werden, um konservierte Lysinrückstände an Nukleotid-Bindungsstelle der GTPase kovalent zu modifizieren. Desthiobiotin-GTP kann Zielenzymklassen selektiv in Proben anreichern, identifizieren und profilieren. Die Vorinkubation von Proben mit kleinen Molekülinhibitoren, die mit Sonden an aktiven Stellen konkurrieren, kann zur Bestimmung der Bindungsaffinität und Zielspezifität von Hemmstoffen verwendet werden. Die ActivX Desthiobiotin-GTP-Sonde markiert kovalent den aktiven Standort von GTPasen und GTPase Untereinheiten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren.

Anwendungen der ActivX Desthiobiotin-GTP Sonde:
• Breite Anreicherung von GTP-bindenden Proteinen aus Geweben, Zellen und subzellulären Proteomen
• Anreicherung von Enzymen auf Basis von Funktionen
• Profilierung von Dutzenden bis Hunderten von Hemmstoffzielen

Die Beurteilung der Kennzeichnung im aktiven Zentrum mit Desthiobioin-Sonden kann entweder mit Western Blot oder mit Massenspektrometrie (MS) erfolgen. Für den Western Blot-Ablauf werden desthiobiotin-markierte Proteine für die SDS-PAGE-Analyse und den anschließenden Nachweis mit spezifischen Antikörpern angereichert. Für den MS-Ablauf werden Desthiobiotin-markierte Proteine reduziert, alkyliert und enzymatisch zu Peptiden verdaut. Nur die Peptide an den mit Desthiobiotin markierten, aktiven Stellen werden für die Analyse mit LC-MS/MS angereichert. Beide Arbeitsabläufe können zur Bestimmung der Bindung von Hemmstoffzielen verwendet werden, aber nur der MS-Arbeitsablauf kann globale Hemmstoffziele und Off-Targets identifizieren.

Diese Produkte unterliegen einer eingeschränkten Nutzungslizenz für die Marke.