Technologische Fortschritte in der Fluoreszenzmikroskopie
Einführung
Die Fluoreszenzmikroskopie (FM) hat die Forschung in den Biowissenschaften revolutioniert. Sie bietet einen beispiellosen Einblick in dynamische biologische Strukturen und Prozesse von der molekularen bis zur organismischen Ebene und verändert unser Verständnis von zellulärer und subzellulärer Organisation, Mechanismen, Interaktionen und Entwicklung. Obwohl es die FM bereits seit über 100 Jahren gibt, hat sie sich in den letzten 30 Jahren durch außerordentliche technologische Fortschritte als leistungsfähiges und dennoch erschwingliches Bildgebungsinstrument etabliert, das für praktisch jedes Labor zugänglich ist.
Der Aufstieg der Fluoreszenzmikroskopie
Die Fluoreszenzmikroskopie hat eine Geschichte voller Innovationen und wichtiger Durchbrüche. Die ersten Fluoreszenzmikroskope entstanden nach der Entwicklung von UV-Mikroskopen in den frühen 1900er Jahren, nachdem über 50 Jahre lang darüber spekuliert und diskutiert worden war. In den 1940er und 1950er Jahren konjugierten der Immunologe Albert Coons und seine Kollegen fluoreszierende Verbindungen (Fluorophore) mit primären und sekundären Antikörpern, um Antigene nachzuweisen, woraus die moderne Immunfluoreszenz-Bildgebung (IF) entstand. Osamu Shimomuras Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in Quallen im Jahr 1961 lieferte ein weiteres wichtiges Werkzeug für die FM, das jedoch erst drei Jahrzehnte später zum Einsatz kommen sollte. Die erste Version des modernen Epifluoreszenzmikroskops erschien 1967 mit der Einführung von strahlteilenden dichroitischen Spiegeln durch Brumberg und Ploem.
Die explosionsartige Zunahme der Vielfalt fluoreszierender Marker in den 1990er Jahren markierte einen Wendepunkt und den Beginn einer rasanten technologischen Entwicklung, die zu einer massiven Ausweitung der FM-Anwendungen führte. Die Sequenzierung von GFP und die anschließende transgene Expression eröffneten neue Möglichkeiten der Fluoreszenzbildgebung, die eine sehr gezielte Markierung lebender Organismen ermöglichte. Die Entwicklung zahlreicher Varianten und anderer fluoreszierender Proteine folgte rasch, während die gleichzeitige Verbesserung und Diversifizierung synthetischer Fluorophore die IF und andere Anwendungen, die zuvor durch Farbstoffbeschränkungen behindert wurden, vorantrieb. Neue Farbstoffe, wie die weit verbreiteten Alexa-Fluor-Farbstoffe, waren photostabiler, pH-unempfindlich und heller und behielten ihre Leuchtkraft bei, wenn sie konjugiert wurden. Die daraus resultierende Vergrößerung des Spektralbereichs und die Vielfalt der Fluorophore brachten mehr Flexibilität, eine tiefere Bildgebung und verbesserte Multiplexing-Möglichkeiten.
In den letzten Jahrzehnten haben sich die Innovationen bei Mikroskopen, Beleuchtungssystemen, Methoden, Chemie und Bildverarbeitung in rasantem Tempo weiterentwickelt und ermöglichen immer komplexere, höher aufgelöste Untersuchungen. So können zum Beispiel schnelle zelluläre oder molekulare Interaktionen in Echtzeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit erschwinglichen Tischgeräten beobachtet werden.
Fluoreszenz - Überlegungen zur Gestaltung
Der Erfolg von Fluoreszenz-Bildgebungsstudien hängt weitgehend von der Auswahl der Marker und der FM-Technologie ab. Bei der Wahl der Marker spielen komplexe Überlegungen eine Rolle, einschließlich miteinander verbundener Faktoren in Bezug auf das Experiment, die verwendete Technologie und das erforderliche Maß an Empfindlichkeit und Spezifität. Synthetische Fluorophore werden in der Regel an Zielmoleküle wie Antikörper oder andere Proteine und Oligonukleotide konjugiert und sind in einer breiten Palette von Fluorophor-Reagenzien und vorgefertigten Konjugaten erhältlich. Fluoreszierende Marker können die Funktion, Lokalisierung oder Dynamik eines Zielmoleküls beeinträchtigen und müssen daher sorgfältig auf ihre Anwendung und Funktionalität hin geprüft werden.
Multiplexing verwendet komplementäre Markersätze, um mehrere Ziele oder Ereignisse gleichzeitig abzubilden. Es ist für viele Studien unerlässlich, erfordert aber zusätzliche Überlegungen, wie die relative Signalstärke und das Potenzial für Kreuzreaktivität. Das Mapping der Anregungs- und Emissionsspektren von Fluorophoren zur Vermeidung von spektralen Überschneidungen ist entscheidend für die Gewinnung zuverlässiger Daten und wurde mit Fluorescence SpectraViewer, einem kostenlosen Online-Tool, vereinfacht.
Dabei werden in der Regel primäre Antikörper verwendet, die an das Zielantigen binden, das dann von Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpern gebunden wird, die auf die Wirtsspezies und die Immunglobulinklasse des primären Antikörpers abzielen. Falls erforderlich, können Zielmoleküle mit geringer Häufigkeit mit Biotin-bindenden Proteinen wie Streptavidin oder anderen Methoden wie der Tyramid-Signalverstärkung (TSA) weiter verstärkt werden. In bestimmten Fällen kann die direkte Markierung mit konjugierten primären Antikörpern die Protokolle vereinfachen oder verbessern, insbesondere beim Multiplexing.
Antikörper müssen sowohl hinsichtlich ihrer Spezifität als auch ihrer Anwendungsleistung (z. B. Immunhistochemie (IHC) oder Immunzytochemie) validiert werden, um genaue und wiederholbare Ergebnisse zu gewährleisten. Die Kreuzadsorption zur Eliminierung der Kreuzreaktivität verbessert die Leistung, insbesondere bei Multiplexing-Studien. Die Verwendung unterschiedlicher Spezies für die primären Antikörper ist ebenfalls erforderlich, um Kreuzreaktivität zu vermeiden.
Viele FM-Technologien unterscheiden sich in erster Linie durch ihre Beleuchtungs- und Detektorsysteme. Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskope sind die einfachsten, vielseitigsten und am häufigsten verwendeten Plattformen, die traditionell eine intensive Breitbandlichtquelle mit optischen Filtern zur Beleuchtung der Probe verwenden. Sie sind schnell, einfach zu bedienen, erschwinglich und bieten eine für viele Anwendungen ausreichende Bildqualität und Auflösung. Ihre schnelle Bildgebungsfähigkeit bei niedrigeren Lichtintensitäten macht sie ideal für die Bildgebung von lebenden Zellen, insbesondere wenn sie mit modernen LED-Lichtquellen weiter verstärkt werden. Bei der optischen Schnittmikroskopie, wie der konfokalen Lichtblattmikroskopie und der Multiphotonenmikroskopie, wird eine hochintensive Laserbeleuchtung eingesetzt und die Detektion auf die Fokusebene beschränkt. Dies ermöglicht die Erstellung eines dreidimensionalen Datensatzes durch die Erfassung mehrerer Ebenen in der Z-Dimension und reduziert die Hintergrundfluoreszenz für eine höher aufgelöste Bildgebung. Lichtblattmikroskope beleuchten die Proben nur entlang der Fokusebene und verwenden ein dünnes Blatt mit Laseranregung senkrecht zur Bildaufnahme für eine sehr schnelle Bildgebung. Einige Geräte sind multimodal und können zwischen Beleuchtungs- und/oder Detektionsmethoden wechseln. Selbst innerhalb der verschiedenen Technologien unterscheiden sich die Geräte in wichtigen Parametern wie Empfindlichkeit und Effizienz, die sich auf die Datenqualität und das Studiendesign auswirken.
Jüngste Trends
Die zunehmende Konzentration auf die Biologie auf Systemebene und die Notwendigkeit, mehr als sechs Ziele gleichzeitig zu beobachten, hat zu einer verstärkten Multiplexing-Fähigkeit geführt, die lange Zeit durch die spektrale Überlappung der Fluoreszenzpaletten eingeschränkt wurde. Neue Techniken und Rechenkapazitäten haben zu "Super-Multiplex"- und "Ultra-Multiplex"-Bildgebung von 15 oder mehr Zielen geführt. Diese Methoden nutzen die alternativen kontrastierenden Eigenschaften von Farbstoffen mit überlappenden Emissionsspektren, z. B. durch die Messung chemischer Bindungsschwingungen oder zeitlicher Stabilität und/oder durch die Anwendung fortgeschrittener algorithmischer Verfahren zur spektralen Entmischung.
Die Entwicklung und Verwendung von LED-Beleuchtungsquellen in der FM hat einen rasanten Aufschwung erlebt, wobei die neue Diodentechnologie und die ständig steigende Leistung zu ihrer wachsenden Bedeutung für verschiedene Anwendungen beitragen. Mehrere wichtige Vorteile gegenüber herkömmlichen Lichtbogenlampen tragen zu ihrer Beliebtheit bei. Die Bestrahlungsstärke (Lichtintensität) von LEDs kann bei FM-Anwendungen mit Bogenlampen mithalten, ist aber dimmbar, so dass keine Neutraldichtefilter mehr benötigt werden. Die Abbildungsgeschwindigkeit wird ohne Blenden oder Filterräder erhöht, da die Lampen mit Mikrosekundengenauigkeit ein- und ausgeschaltet werden können und Filter an einzelnen Dioden angebracht werden können. LED-Beleuchtung ist auch nachhaltiger, mit einer Lebensdauer, die mindestens 1-2 Größenordnungen länger ist als die von Bogenlampen, einem Zehntel des Energieverbrauchs und ohne die Gesundheits-, Sicherheits- und Umweltrisiken, die das Quecksilber in Bogenlampen birgt.
Ein wichtiges Thema bei der Beleuchtung mit LED-Quellen ist die Verringerung der Intensität, Dauer und Menge der Lichteinwirkung auf die Proben, wodurch die Signalstärke verbessert, das Rauschen reduziert und die Beschädigung der Proben minimiert wird. Die Dioden sind in diskreten Wellenlängenkanälen von 340 nm (UV) bis 780 nm (nahes IR) für eine selektive Mehrkanal-Wellenlängenbeleuchtung erhältlich, die sich für eine Vielzahl von Anwendungen eignet, darunter Hochgeschwindigkeits-Live-Cell-Imaging, Kalzium-Imaging, Optogenetik und Förster-Resonanzenergietransfer. Die LED-Beleuchtung wird häufig in der Super-Resolution-Mikroskopie als Hilfslicht für die Vorschau der interessierenden Regionen eingesetzt, hat sich aber auch in der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie mit kamerabegrenzter Aufnahmegeschwindigkeit als erfolgreich erwiesen. Die räumlich modulierte selektive Volumenbeleuchtung mit einer LED-Quelle hat ebenfalls ähnliche Ergebnisse wie die Lichtblattmikroskopie erbracht. Obwohl die Fähigkeit, es mit der Laserbeleuchtung in der FM aufzunehmen, noch sehr begrenzt ist, erzeugt LED-Licht mit niedriger Kohärenz weniger Speckle- oder Schattenartefakte als Laserstrahlen mit hoher Kohärenz, was die Bildqualität verbessern kann.
Aktuelle Herausforderungen und Innovationen
Fotobeschädigung
Photobleiche (lichtinduzierte Schädigung von Fluorophoren) und Phototoxizität (lichtinduzierte Schädigung lebender Zellen) sind für die meisten Anwendungen in der FM ein ständiges Problem und werden sowohl durch die Dauer als auch die Intensität der Anregungsbeleuchtung bestimmt. Photobleaching verhindert dauerhaft die Fluoreszenz und wird durch photoneninduzierte Veränderungen in der Molekularstruktur des Fluorophors verursacht. Phototoxizität kann sich negativ auf Wachstum, Replikation, Funktion und Lebensfähigkeit von Zellen auswirken. Die meisten Taktiken zur Eindämmung beider Phänomene drehen sich um die Begrenzung der Lichtexposition durch zeitliche, räumliche, intensive und spektrale Kontrollen.
Zu den traditionellen Beleuchtungskontrollen gehören Jalousien und Filter für Wellenlänge, Lichtintensität (neutrale Dichte), UV-Blockierung und Wärme. Umgekehrt ist die stark reduzierte Lichtexposition, die durch hochgradig kontrollierte, programmierbare LED-Quellen möglich ist, für die Live-Bildgebung von unschätzbarem Wert. Obwohl eine längere Beleuchtungsdauer bei geringerer Intensität am besten ist, verursacht gepulstes oder stroboskopisches Licht mit hoher Intensität aufgrund der Ruhezeit für angeregte Fluorophore weniger Lichtschäden als anhaltendes Licht mit hoher Intensität. FM-Technologien, die die Beleuchtung auf die Fokusebene beschränken, wie z. B. Light-Sheet und interne Totalreflexion, sind die schonendsten und lichteffizientesten Optionen. Längere Wellenlängen (z. B. Rot-IR), wie sie für die Multiphotonenmikroskopie verwendet werden, sind wesentlich weniger schädlich als energiereichere Wellenlängen (z. B. UV-Blau).
Die Auswahl von Fluorophoren mit verbesserter Photostabilität verringert das Photobleaching und die damit verbundene Phototoxizität. Darüber hinaus kann eine bessere Erkennungseffizienz Bilder mit höherem Signal-Rausch-Verhältnis bei geringerer Anregungsbeleuchtung ermöglichen. Schließlich können Antifade-Reagenzien das Photobleaching sowohl bei lebenden als auch bei fixierten Proben erheblich reduzieren, so dass die Signalintensität über die Zeit und über das Spektrum hinweg erhalten bleibt. Antifade-Lösungen können auch die Phototoxizität bei einigen Probentypen verringern.
Live-Cell Imaging
Die Arbeit mit lebenden Zellen bringt viele eigene Herausforderungen mit sich. Lebende Zellen müssen in ihrem natürlichen physiologischen Zustand und in einem gesunden Zustand gehalten werden, um biologisch relevante Ergebnisse zu erzielen. Zellfunktionen und -prozesse reagieren sehr empfindlich auf veränderliche Bedingungen wie Temperatur, pH-Wert und Sauerstoff, die für zuverlässige und wiederholbare Ergebnisse streng kontrolliert werden müssen. Ein Inkubator für lebende Zellen ist erforderlich, wenn die Temperatur und/oder das Gasgemisch, das die Zellen benötigen, erheblich von den Umgebungsbedingungen abweicht. Handelsübliche Medienlösungen können auch dazu beitragen, die Lebensfähigkeit der Zellen während des Beladens mit Farbstoffen, des Waschens und der Bildgebung unter Umgebungsbedingungen aufrechtzuerhalten und gleichzeitig die Bildklarheit und das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.
Einige Fluoreszenztechniken sind von Natur aus schädlich für Zellen oder Gewebeproben, was zu weiteren Innovationen bei der Beleuchtung (siehe oben) und bei den Markern führt. Fluoreszenzmarker können für lebende Zellen toxisch sein - die Phototoxizität von Fluorophoren ergibt sich aus der Bestrahlung und der anschließenden Bildung reaktiver Sauerstoffspezies in der Zelle, während die Chemotoxizität aus der chemischen Natur des Fluorophors selbst resultiert. Die Toxizität variiert je nach Marker, Zelltyp und Organismus und sollte daher in der Planungsphase geprüft werden. Die Verwendung effizienterer Farbstoffe oder empfindlicherer Bildgebungsverfahren, die eine geringere Farbstoffkonzentration ermöglichen, war ein wichtiger Faktor bei der Begrenzung der Toxizität von Markern.
Durchlässigkeit
Die Permeabilität kann bei der Arbeit mit fixierten oder lebenden Zellen eine Herausforderung darstellen. Die Erhöhung der Permeabilität von fixierten Zellen unter Beibehaltung der Integrität der Strukturen kann durch Fixierungs- und Permeabilisierungskits unterstützt und stark vereinfacht werden. Die Markierung von lebenden Zellen stellt eine größere Herausforderung dar, da Zellmembranen im Allgemeinen nicht für Antikörper durchlässig sind und die Permeabilisierung lebende Zellen schädigt oder zerstört. Antikörper können dennoch zur Färbung von Zellmembranen oder zur Verfolgung von Internalisierungsprozessen oder durch Expression von Intrabodies (intrazelluläre Antikörper) verwendet werden. Am häufigsten werden lebende Zellen durch den Einsatz gezielter fluoreszierender Proteine oder kleiner membrandurchlässiger Reagenzien markiert. Fluoreszierende Proteine werden in der Regel als genetische Konstrukte in lebende Zellen eingebracht, z. B. durch Lipidtransfektion oder virale Transduktion, wonach die exogene DNA exprimiert wird.
Die Markierung lebender Zellen kann durch eine Reihe kommerzieller Reagenzien erheblich vereinfacht werden. Die CellLight-Reagenzien beispielsweise enthalten gebrauchsfertige Konstrukte, die in erster Linie für die Markierung von Organellen verwendet werden. Sie können einer Kultur zugesetzt werden, damit sie in der Nacht vor der Bildgebung von den Zellen aufgenommen werden, ähnlich wie bei einer Färbung, so dass keine molekularbiologischen Techniken erforderlich sind. Eine weitere Option für die intrazelluläre Markierung sind zellpermeable Farbstoffe, die innerhalb der Zellen undurchlässige Reaktionsprodukte bilden, wie die CellTracker-Reagenzien. Fluorogene wie pHrodo-Indikatoren, die als intrazelluläre pH-Sensoren fungieren und besonders für Endozytose-, Phagozytose- und Sequestrationsstudien nützlich sind, können in einer Vielzahl von Formaten für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, z. B. als Farbstoff zur Messung des zytosolischen pH-Werts oder konjugiert mit Liganden, Antikörpern oder anderen Partikeln, um Internalisierungsstudien zu erleichtern.
Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses
Die Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR), das in der Forschung stets ein wichtiges Anliegen ist, wirkt sich auf die praktische Auflösung, die Genauigkeit und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse aus; außerdem hat es eine der direktesten Auswirkungen auf die wahrgenommene Bildqualität. Das SNR wird in hohem Maße durch das Mikroskop beeinflusst, einschließlich seiner Beleuchtung, Objektive, Detektoren und Ausrichtung, was die Technologie zu einem entscheidenden Faktor bei der Planung macht. Darüber hinaus wird das SNR auch durch die Dichte und/oder Helligkeit des Fluorophors beeinflusst. Die Optimierung der Beleuchtung und der Marker, einschließlich der Konjugate und Anregungs-/Emissionsspektren, kann das SNR erheblich verbessern.
Mehrere handelsübliche Reagenzien können durch Signalverstärkung oder Rauschunterdrückung ebenfalls zur SNR-Optimierung beitragen. Das Signal für Targets mit sehr geringer Abundanz kann mit TSA erhöht werden, das eine Verstärkung mit hoher Klarheit und hoher Auflösung bietet. Die Kombination von TSA-Behandlung mit Hochleistungsfarbstoffen kann die Empfindlichkeit und Präzision um das 10- bis 200-fache im Vergleich zu Standardmethoden erhöhen. Das Rauschen kann mit Blockierlösungen oder Hintergrundunterdrückern reduziert werden. Blockierungsproteine werden von hochaffinen Antikörpern verdrängt und blockieren gleichzeitig Wechselwirkungen mit geringerer Affinität, um unspezifische Färbungen zu reduzieren. Sie können allgemein oder spezifisch für bestimmte Konjugate sein, wie z. B. biotinbindende Proteine. Allgemeine Hintergrundunterdrücker können auch bei der Abbildung lebender Zellen in blauen, grünen und roten Kanälen hilfreich sein.
Schlussfolgerungen
Die Fortschritte bei kommerziellen Systemen haben die Qualität, Zuverlässigkeit und Erschwinglichkeit der Fluoreszenzmikroskopie erheblich verbessert. Viele neuere Systeme sind leistungsfähig und einfach zu bedienen, was den Zugang zu qualitativ hochwertigen Daten verbessert. Die EVOS-Mikroskopreihe bietet zusätzliche Funktionen für automatisierte Zeitrafferfilme, Scannen von Multi-Well-Platten, Image Stitching und Tiling sowie Zellzählung in einem erschwinglichen, modularen System. Es ist mit hellen, langlebigen LED-Lichtquellen in Widefield- und flexiblen, austauschbaren Lichtwürfelkonfigurationen mit Hochleistungsfiltern ausgestattet, die für bestimmte Farbstoffe optimiert sind und einen hohen SNR und publikationsreife Bilder für eine breite Palette von Fluorophoren liefern.
Die Fluoreszenzmikroskopie ist für die Erforschung der räumlichen und funktionellen Biologie unverzichtbar und trägt seit Jahrzehnten dazu bei, die Forschung in zentralen Bereichen der Biowissenschaften neu zu gestalten. Das erstaunliche Tempo von Wachstum und Entwicklung ermöglicht weiterhin neue Forschungszweige mit rasch wachsenden Möglichkeiten. Verbesserungen bei Instrumenten und Chemie sowie sicherere, langlebigere und konsistentere Beleuchtungssysteme machen Tischgeräte leistungsfähiger und erschwinglicher und ermöglichen den weltweiten Zugang zu systemverändernden Forschungs- und Diagnoseinstrumenten. Die Zukunft der FM ist vielversprechend.
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