Acrylamid-Elektrophorese-Gele

Bei der Gelelektrophorese wird Acrylamid verwendet, um ein Polyacrylamidgel zu bilden, das als Matrix dient, durch die Moleküle wie Proteine oder Nukleinsäuren basierend auf ihrer Größe und Ladung getrennt werden können. Hier sind die Hauptrollen und Funktionen von Acrylamid in der Gelelektrophorese:

Gelbildung

Acrylamid, in Kombination mit einem Vernetzer (normalerweise N,N'-Methylenbisacrylamid), durchläuft eine Polymerisationsreaktion, um ein Polyacrylamidgel zu bilden. Dieses Gel besteht aus einem Netzwerk langer Polymerketten, die miteinander vernetzt sind und eine poröse Struktur schaffen.

Kontrolle der Porengröße

Die Konzentration von Acrylamid und das Verhältnis von Acrylamid zu Bisacrylamid bestimmen die Porengröße des Gels. Höhere Konzentrationen von Acrylamid erzeugen kleinere Poren, die eine höhere Auflösung für die Trennung kleinerer Moleküle bieten. Umgekehrt erzeugen niedrigere Konzentrationen größere Poren, die für die Trennung größerer Moleküle geeignet sind. Typische Acrylamidkonzentrationen reichen von 3-20 %, wobei niedrigere Prozentsätze für größere Moleküle und höhere Prozentsätze für kleinere Moleküle verwendet werden.

Auflösung und Trennung

Das Polyacrylamidgel wirkt als molekulares Sieb. Kleinere Moleküle bewegen sich leichter durch die Poren und wandern daher schneller, während größere Moleküle behindert werden und langsamer wandern. Diese größenabhängige Migration ermöglicht die Trennung von Molekülen basierend auf ihrer Größe.

Bei der Proteinelektrophorese, wie der SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis), werden Proteine denaturiert und mit SDS beschichtet, was ihnen eine einheitliche negative Ladung verleiht. Das Polyacrylamidgel trennt die Proteine dann hauptsächlich nach Größe.

Stabilität und Vielseitigkeit

Polyacrylamidgele sind chemisch stabil und können für eine Vielzahl von elektrophoretischen Techniken verwendet werden, einschließlich der nativen PAGE (bei der Proteine nicht denaturiert werden) und der denaturierenden PAGE (wie SDS-PAGE). Die Gele können in verschiedenen Dicken und Formaten gegossen werden, einschließlich Plattengele und Röhrchengele, je nach den experimentellen Anforderungen.

Agarose- und Acrylamid-Gelelektrophorese sind zwei gängige Techniken zur Trennung von Molekülen, typischerweise Nukleinsäuren und Proteinen, basierend auf ihrer Größe und Ladung. Die Hauptunterschiede zwischen den beiden sind:

Gelzusammensetzung

Agarose-Gelelektrophorese verwendet Agarose, ein Polysaccharid, das aus Algen gewonnen wird. Das Gel wird gegossen, indem Agarosepulver in einer Pufferlösung gelöst und abkühlen und fest werden gelassen wird. Acrylamid-Gelelektrophorese verwendet Polyacrylamid, das durch die Polymerisation von Acrylamidmonomeren mit einem Vernetzer (normalerweise Bisacrylamid) gebildet wird. Der Polymerisationsprozess wird chemisch initiiert.

Porengröße

Agarose hat relativ große Poren, was es geeignet macht für die Trennung größerer Moleküle wie DNA-Fragmente (typischerweise von 100 bp bis mehrere kb). Acrylamid hat kleinere, gleichmäßigere Poren, die für die Trennung kleinerer Moleküle wie Proteine und kleine Nukleinsäuren geeignet sind (typischerweise von 5 bp bis 1 kb).

Auflösung

Agarose bietet eine geringere Auflösung aufgrund der größeren Porengröße, ideal für die Trennung großer DNA-Fragmente, aber weniger effektiv für kleine Fragmente oder Proteine. Acrylamid bietet eine höhere Auflösung aufgrund der kleineren Porengröße, was es ideal macht für die Unterscheidung zwischen Proteinen oder kleinen Nukleinsäurefragmenten mit kleinen Größenunterschieden.

Anwendungen

Agarose wird häufig für die Elektrophorese von DNA und RNA verwendet, insbesondere für Routineanalysen wie die Überprüfung der Größe von PCR-Produkten, Restriktionsverdauungen und RNA-Integrität. Acrylamid wird häufig für die Proteinelektrophorese (SDS-PAGE) und hochauflösende DNA-Sequenzierungsgels sowie für die Trennung kleiner Nukleinsäurefragmente verwendet.

Vorbereitung und Handhabung

Agarose ist einfacher und sicherer vorzubereiten, da keine toxischen Chemikalien verwendet werden. Einfach in Puffer lösen, erhitzen und in eine Form gießen. Acrylamid ist komplexer und erfordert eine sorgfältige Handhabung aufgrund der Toxizität der Acrylamidmonomere. Die Polymerisation muss sorgfältig kontrolliert werden, normalerweise mit der Zugabe von TEMED und Ammoniumpersulfat.

Laufpuffer

Agarose verwendet häufig TAE (Tris-Acetat-EDTA) oder TBE (Tris-Borat-EDTA) Puffer. Acrylamid verwendet typischerweise Tris-Glycin-SDS-Puffer für die Proteinelektrophorese (SDS-PAGE).

Bei der Auswahl von Acrylamid-Elektrophorese-Gelen gibt es mehrere wichtige Faktoren zu berücksichtigen, um eine optimale Trennung und Analyse Ihrer Proben zu gewährleisten. Hier sind fünf wichtige Überlegungen:

1. Acrylamidkonzentration: Die Konzentration von Acrylamid im Gel bestimmt die Porengröße, die direkt die Auflösung und den Bereich der Molekülgrößen beeinflusst, die getrennt werden können. Niedrigere Konzentrationen (z.B. 5-8%) werden für größere Proteine oder Nukleinsäuren verwendet, während höhere Konzentrationen (z.B. 10-20%) für kleinere Proteine oder Nukleinsäuren verwendet werden. Gradientengele, die unterschiedliche Acrylamidkonzentrationen haben, können verwendet werden, um eine breite Palette von Molekülgrößen in einem einzigen Gel zu trennen.
2. Geltyp (denaturierend vs. native): Denaturierende Gele werden verwendet, um Moleküle nur nach Größe zu trennen, mit der Verwendung von denaturierenden Agenzien wie SDS (SDS-PAGE für Proteine) oder Harnstoff (für Nukleinsäuren). Diese Gele stören sekundäre und tertiäre Strukturen und verleihen den Molekülen ein einheitliches Verhältnis von Ladung zu Masse. Native Gele werden verwendet, um Moleküle basierend auf ihrer nativen Konformation, Ladung und Größe zu trennen. Diese Gele enthalten keine denaturierenden Agenzien und bewahren die natürliche Struktur und Funktion der Moleküle.
3. Buffersystem: Die Wahl des Puffers kann die Auflösung, die Laufbedingungen und die am besten durch das Gel getrennten Molekültypen beeinflussen. Gängige Buffersysteme umfassen Tris-Glycin für SDS-PAGE und Tris-Borat-EDTA (TBE) oder Tris-Acetat-EDTA (TAE) für Nukleinsäuren. Stellen Sie sicher, dass das Buffersystem mit der durchgeführten Elektrophorese und den analysierten Molekülen kompatibel ist.
4. Gelstärke und Format: Die Dicke des Gels kann die Auflösung und die Menge der geladenen Probe beeinflussen. Dickere Gele können größere Probenvolumina aufnehmen, erfordern jedoch möglicherweise längere Laufzeiten. Das Format des Gels (z.B. Plattengele, Gradientengele oder Röhrchengele) sollte basierend auf der spezifischen Anwendung und der verfügbaren Ausrüstung ausgewählt werden.
5. Polymerisation und Gelvorbereitung: Berücksichtigen Sie den Polymerisationsprozess und die Handhabung von Acrylamid, das in seiner monomeren Form ein Neurotoxin ist. Stellen Sie sicher, dass während der Gelvorbereitung geeignete Sicherheitsprotokolle befolgt werden. Die Polymerisationsbedingungen (z.B. die Konzentration von TEMED und Ammoniumpersulfat) sollten optimiert werden, um eine konsistente und gleichmäßige Gelmatrix zu erzeugen.

Durch Berücksichtigung dieser Faktoren können Sie die am besten geeigneten Acrylamid-Elektrophorese-Gele für Ihre spezifischen Forschungsbedürfnisse auswählen und zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse sicherstellen.