Thermo Scientific™ Dulbecco's Modified Eagle's Limiting Medium (DMEM-LM)

Thermo Scientific L-Photo-Leucin und L-Photo-Methionin sind Analoga von L-Leucin- und L-Methionin-Aminosäuren, die aktivierbare Diazirin-Seitenketten besitzen, die bei UV-Licht eine chemische Vernetzung mit benachbarten Molekülen ermöglichen. Wie ihre natürlich vorkommenden Gegenstücke können diese fotoreaktiven Aminosäuren während der Synthese endogen in die Primärsequenz von Proteinen integriert werden. Protein-zu-Protein-Interaktionsdomänen, die die synthetisierten Proteine in ihrer nativen Umgebung einbeziehen, können so durch Aktivierung der Diaziringruppen kovalent vernetzt werden. Herkömmliche Vernetzungsexperimente erfordern die Zugabe von bifunktionalen chemischen Crosslinkern und entsprechenden Reagenzienlösungsmitteln, was sich negativ auf die zu untersuchende Zellbiologie auswirken kann. Durch die Verwendung von fotoreaktiven Aminosäuren werden diese potenziell schädlichen Wirkungen minimiert und sowohl stabile als auch transiente Proteininteraktionen in Zellen können mit einem hohen Grad an Zuverlässigkeit untersucht und charakterisiert werden. In Kombination mit speziell formulierten limitierenden Zellmedien, die kein Leucin und Methionin enthalten, werden die fotoaktivierbaren Derivate von den Proteinsynthesegeräten wie natürlich vorkommende Aminosäuren behandelt. Dadurch können sie in der Primärsequenz von Proteinen durch Leucin oder Methionin substituiert werden. Bei UV-Licht werden die Diazirinringe zu reaktiven Zwischenprodukten, die kovalente Bindungen zu nahe gelegenen Proteinseitenketten und Backbones bilden. Natürlich bindende Partner werden dann sofort eingefangen. Quervernetzte Proteinkomplexe werden bei SDS-PAGE durch verringerte Mobilität erkannt, gefolgt von Western Blot-Nachweis, Größenausschluss-Chromatographie, Saccharosedichte-Gradienten-Sedimentation oder Massenspektrometrie.

Besondere Merkmale:

• In-vivo-Markierung – Integration photoreaktiver Gruppen in Proteine mit normalen Zellgeräten

• In-vivo-Vernetzung – Finden interagierender Proteine in der nativen zellulären Umgebung

• Erhöhte Spezifität im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren – Vernetzen interagierender Proteine, die ordnungsgemäß an ihren Schnittstellen positioniert sind, innerhalb von Proteininteraktionsdomänen

• Ergänzen herkömmliche Verfahren – Genaue Charakterisierung von Proteininteraktionen im Vergleich zu Ergebnissen mit Formaldehyd und anderen allgemeineren Vernetzungsmethoden

• Effiziente Rückgewinnung – von 90 % Proteinen in Zelllysaten nach Vernetzung

• Kompatibel – Vernetzungsproteine, die in einer Vielzahl von Zelllinien einschließlich HeLa, 293T, COS7, U2OS, A549, A431, HepG2, NIH 3T3 und C6 exprimiert werden

• Anwenderfreundlich – Reagenzien sind bei normaler Laborbeleuchtung lichtbeständig, sodass keine Arbeit im Dunkeln mehr erforderlich ist