Invitrogen™ LiveBLAzer™ FRET-B/G Loading Kit with CCF2-AM

Beschreibung

LiveBLAzer™ FRET-B/G Loading Kit with CCF2-AM

Hintergrund:
GeneBLAzer™ Zellbasierte Assays verwenden die membrandurchdringenden Esterformen (CCF2-AM und CCF4-AM) der negativ geladenen fluoreszierenden Beta-Lactamase-Substrate CCF2 und CCF4. Diese lipophilen Ester gelangen problemlos in die Zelle. Dort werden sie durch Spaltung durch endogene zytoplasmatische Esterasen schnell in ihre negativ geladenen Formen umgewandelt und dadurch im Zytosol eingeschlossen.

Der Nachweis von GeneBLAzer™ Assays erfolgt auf FRET-Basis. Jedes Substrat wird mit zwei Fluorophoren markiert, die ein effizientes FRET-Paar bilden. Ohne Beta-Lactamase-Aktivität führt die Anregung des Cumarins bei 409 nm im intakten CCF2-Molekül im FRET zum Fluorescein, das bei 518 nm ein grünes Fluoreszenzsignal aussendet (Abbildung 1). Bei der Beta-Lactamase-Aktivität trennt die Spaltung von CCF2 die beiden Farbstoffe räumlich und unterbricht den FRET, so dass die Anregung des Cumarins bei 409 nm nun ein blaues Fluoreszenzsignal mit 447 nm erzeugt. Dieses blaue Signal kann problemlos unter einem Mikroskop beobachtet und zudem als Erhöhung der Anzeige im blauen Kanal des Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegeräts nachgewiesen werden.

Die CCF2-AM- und CCF4-AM-Substrate sind wesentliche Assay-Komponenten für die GeneBLAzer™ Plattform. Diese Substrate sind vollständig kompatibel mit der Durchflusszytometrie, wodurch die Zeit bis zur Klonauswahl verkürzt wird. Die ratiometrische Analyse der blauen und grünen Signale reduziert die Variation zwischen den Wells aufgrund von Unterschieden bei Zellzahlen und Substratbeladung und führt so zu hohen Z´-Faktorwerten und niedrigen Variationskoeffizienten (CVs).

CCF2-AM und CCF4-AM unterscheiden sich durch zwei Kohlenstoffe in der Brücke, die den Cumarin-Anteil mit dem Lactam-Ring verbindet. Beide sind membrandurchdringend, verestert und können für Assays in intakten Zellen verwendet werden. CCF4-AM hat bessere Löslichkeitseigenschaften (> 24 Stunden lang löslich) als CCF2-AM und eignet sich daher besonders gut für Screening-Anwendungen. Darüber hinaus hat CCF4-AM einen etwas besseren FRET und damit einen etwas geringeren Hintergrund als CCF2-AM.

CCF2-FA ist im Wesentlichen das CCF2-Substrat ohne die in der AM-Version vorhandenen Ester. CCF2-FA wird entestert und in Zelllysat-Anwendungen verwendet, wobei die Belastung der Zellmembran und die Entesterungsschritte umgangen werden. Zelllysate sind die bevorzugte Methode für Anwendungen mit Zellen, die eine Zellwand enthalten. CCF2-FA kann auch als Kontrolle zur Erfassung der Anregungs- und Emissionsspektren für CCF2-AM und CCF4-AM verwendet werden.