Western-Blot- und Nukleinsäure-Membranen und Filterpapier

SDS-PAGE und Western Blot sind zwei unterschiedliche, aber komplementäre Techniken zur Analyse von Proteinen. Die wichtigsten Unterschiede sind:

• SDS-PAGE trennt Proteine basierend auf ihrem Molekulargewicht. Western Blot erkennt spezifische Proteine innerhalb eines komplexen Gemischs nach der Trennung durch SDS-PAGE.
• SDS-PAGE verwendet Natriumdodecylsulfat (SDS), um Proteine zu denaturieren und ihnen eine negative Ladung zu verleihen, wodurch sie durch Elektrophorese basierend auf ihrer Größe getrennt werden. Western Blot überträgt Proteine von einem SDS-PAGE-Gel auf eine Membran (wie PVDF oder Nitrocellulose) und verwendet dann spezifische Antikörper, um das interessierende Protein zu erkennen.
• SDS-PAGE-Probevorbereitung (einschließlich Denaturierung mit SDS):
  • Laden der Proben in die Vertiefungen eines Polyacrylamidgels;
  • Elektrophorese zur Trennung der Proteine nach Größe;
  • Färben des Gels (z.B. mit Coomassie Brilliant Blue oder Silberfärbung) zur Visualisierung aller Proteine.
• Western Blot-Probevorbereitung:
  • Durchführung von SDS-PAGE zur Trennung der Proteine;
  • Übertragen der Proteine vom Gel auf eine Membran;
  • Blockieren der Membran, um unspezifische Bindungen zu verhindern;
  • Inkubieren mit einem primären Antikörper, der spezifisch für das Zielprotein ist;
  • Inkubieren mit einem sekundären Antikörper, der an den primären Antikörper bindet und an ein nachweisbares Enzym oder Fluorophor konjugiert ist;
  • Erkennen des Zielproteins mit geeigneten Nachweismethoden (z.B. Chemilumineszenz, Fluoreszenz).
• SDS-PAGE visualisiert alle Proteine in der Probe mit einer allgemeinen Protein-Färbung. Western Blot erkennt spezifisch das interessierende Protein mit Antikörpern und liefert Informationen über die Präsenz, Größe und Menge des Zielproteins.
• SDS-PAGE bietet ein Profil des Proteingemischs und zeigt die relativen Größen und Mengen aller vorhandenen Proteine. Western Blot hingegen liefert spezifische Informationen über das Zielprotein, einschließlich seiner Präsenz, seines Molekulargewichts und seiner relativen Häufigkeit.

Zusammengefasst wird SDS-PAGE hauptsächlich zur Trennung von Proteinen nach Größe verwendet, während Western Blotting zur spezifischen Erkennung und Analyse einzelner Proteine innerhalb eines komplexen Gemischs nach Trennung durch SDS-PAGE verwendet wird.

Die Wahl zwischen PVDF (Polyvinylidenfluorid) und Nitrocellulosemembranen beim Western Blotting hängt von mehreren Faktoren ab:

Proteinbindungskapazität:

PVDF hat eine höhere Proteinbindungskapazität, typischerweise etwa 150-160 µg/cm². Nitrocellulose hat eine niedrigere Proteinbindungskapazität, typischerweise etwa 80-100 µg/cm².

Haltbarkeit:

PVDF ist langlebiger und widerstandsfähiger gegen Handhabung, wodurch es für mehrfaches Reprobing geeignet ist. Nitrocellulose ist fragiler und anfälliger für Risse, weniger geeignet für mehrfaches Reprobing.

Empfindlichkeit:

PVDF bietet oft eine höhere Empfindlichkeit für die Erkennung von Proteinen in geringer Menge. Nitrocellulose ist für die meisten Anwendungen ausreichend, könnte jedoch weniger empfindlich im Vergleich zu PVDF sein.

Hintergrundrauschen:

PVDF kann manchmal höheres Hintergrundrauschen zeigen, was strengere Blockierungs- und Waschschritte erfordern kann. Nitrocellulose zeigt typischerweise niedrigeres Hintergrundrauschen.

Kompatibilität mit Färbung:

PVDF ist mit einer Vielzahl von Färbetechniken kompatibel, einschließlich Coomassie Brilliant Blue und Ponceau S. Nitrocellulose ist ebenfalls mit verschiedenen Färbetechniken kompatibel, aber möglicherweise nicht so vielseitig wie PVDF.

Kosten:

PVDF ist im Allgemeinen teurer, während Nitrocellulose weniger teuer ist.

PVDF-Membranen werden bevorzugt wegen ihrer höheren Proteinbindungskapazität, Haltbarkeit und Empfindlichkeit, besonders bei der Arbeit mit Proteinen in geringer Menge oder bei mehrfachen Reprobing. Nitrocellulosemembranen sind geeignet für Routineanwendungen, bei denen Kosten eine Rolle spielen und die interessierenden Proteine in hoher Menge vorhanden sind, und sie zeigen typischerweise niedrigeres Hintergrundrauschen. Wählen Sie basierend auf den spezifischen Anforderungen Ihres Experiments.

Wenn eine PVDF-Membran während des Western-Blotting-Prozesses austrocknet, können mehrere Probleme auftreten:

• Verlust der Proteinbindungskapazität: Sobald die Membran austrocknet, können die daran gebundenen Proteine irreversibel in einer Weise gebunden werden, die für nachfolgende Detektionsschritte möglicherweise nicht optimal ist. Dies kann zu einer verringerten Empfindlichkeit und inkonsistenten Ergebnissen führen.
• Erhöhtes Hintergrundrauschen: Eine getrocknete PVDF-Membran kann während der Detektion ein höheres Hintergrundrauschen aufweisen, was es schwieriger macht, das spezifische Signal der Zielproteine zu unterscheiden.
• Schwierigkeit beim Reprobing: Wenn die Membran austrocknet, kann es schwieriger sein, sie abzublenden und erneut zu proben, da die Effizienz des Abstreifens beeinträchtigt sein kann.
• Physische Schäden: Das Austrocknen kann die Membran spröder machen und anfälliger für Risse oder Brüche, was die Handhabung erschwert und zum Verlust von Proben führen kann.

Um diese Probleme zu vermeiden, ist es entscheidend, die PVDF-Membran während des gesamten Western-Blotting-Prozesses feucht zu halten. Wenn die Membran austrocknet, kann sie manchmal in Methanol oder Wasser rehydriert werden, aber dies stellt möglicherweise nicht vollständig ihre ursprüngliche Funktionalität und Leistung wieder her.