DNA-Sequenzierung

Die grundlegenden Anforderungen für die DNA-Sequenzierung umfassen:

• DNA-Vorlage: Die DNA-Probe, die Sie sequenzieren möchten.
• Primer: Kurze DNA-Fragmente, die den Sequenzierungsprozess initiieren.
• DNA-Polymerase: Ein Enzym, das neue DNA-Stränge synthetisiert, die komplementär zum Vorlagenstrang sind.
• Nukleotide: Die Bausteine der DNA, einschließlich standardmäßiger Nukleotide (dNTPs) und modifizierter Nukleotide (ddNTPs) für die Kettenabbruchsequenzierung nach Sanger.
• Sequenziergerät: Ausrüstung, die die Sequenz der Nukleotide in der DNA liest.
• Puffer und Reagenzien: Chemische Lösungen, die die notwendigen Bedingungen für die Funktion der DNA-Polymerase bereitstellen.
• Thermocycler (für einige Methoden): Ein Gerät, das zur Amplifikation von DNA-Segmenten durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet wird.

Verschiedene Sequenzierungsmethoden können zusätzliche oder spezifische Anforderungen haben, aber dies sind die allgemeinen Komponenten, die für die meisten DNA-Sequenzierungsprotokolle benötigt werden.

Die Menge an DNA, die für die Sequenzierung benötigt wird, hängt von der Sequenzierungsmethode und der verwendeten Plattform ab. Hier sind einige allgemeine Richtlinien:

• Sanger-Sequenzierung:

  • Benötigt typischerweise 10-50 ng gereinigter DNA pro Reaktion

• Next-Generation Sequencing (NGS):

  • Illumina-Sequenzierung: Benötigt in der Regel 1 ng bis 1 µg DNA, abhängig vom spezifischen Bibliotheksvorbereitungsprotokoll
  • Ion Torrent-Sequenzierung: Benötigt normalerweise etwa 10 ng bis 1 µg Eingangs-DNA
  • Pacific Biosciences (PacBio) Sequenzierung: Benötigt typischerweise 0,5 bis 5 µg hochqualitative DNA
  • Oxford Nanopore Sequenzierung: Benötigt etwa 200 ng bis 1 µg DNA, obwohl einige Protokolle mit nur 10 ng auskommen können

• Third-Generation Sequencing:

  • Single-Molecule Real-Time (SMRT) Sequenzierung (PacBio): Benötigt oft 0,5 bis 5 µg hochmolekulare DNA
  • Nanopore Sequenzierung (Oxford Nanopore): Benötigt in der Regel etwa 200 ng bis 1 µg DNA, obwohl einige Protokolle geringere Mengen verwenden können

Diese Mengen können je nach spezifischen Protokollen und Kits variieren, daher ist es wichtig, die Richtlinien des Herstellers der Sequenzierungsplattform und des Bibliotheksvorbereitungskits zu konsultieren, das Sie verwenden.

Sanger-Sequenzierung und Next-Generation Sequencing (NGS) sind zwei verschiedene Methoden zur Bestimmung der Nukleotidsequenz in DNA. Hier sind die Hauptunterschiede zwischen ihnen:

Sanger-Sequenzierung

• Methode: Kettenabbruch mit ddNTPs und Kapillarelektrophorese.
• Leselänge: Lang (500-1000 bp).
• Durchsatz: Niedrig; sequenziert ein Fragment nach dem anderen.
• Genauigkeit: Sehr hoch.
• Anwendungen: Kleinmaßstäbliche Sequenzierung (z.B. einzelne Gene), Validierung von Varianten.
• Kosten: Höher pro Base, aber niedrigere Einrichtungskosten für kleine Projekte.

Next-Generation Sequencing (NGS)

• Methode: Massiv parallele Sequenzierung von Millionen von Fragmenten.
• Leselänge: Kurz bis lang (100-300 bp für Illumina, länger für PacBio/Oxford Nanopore).
• Durchsatz: Hoch; sequenziert ganze Genome, Exome oder Transkriptome.
• Genauigkeit: Hoch, variiert jedoch je nach Plattform.
• Anwendungen: Großmaßstäbliche Sequenzierung (z.B. ganze Genome, Exome, RNA-Seq, gezielte Sequenzierung).
• Kosten: Niedriger pro Base, aber höhere Einrichtungskosten; kosteneffektiv für große Projekte.

Die Sanger-Sequenzierung ist ideal für kleinmaßstäbliche Sequenzierungsprojekte aufgrund ihrer hohen Genauigkeit und längeren Leselängen. Sie ist teurer pro Base, hat jedoch niedrigere Einrichtungskosten für kleine Projekte. NGS eignet sich für großmaßstäbliche Sequenzierungsprojekte aufgrund seines hohen Durchsatzes und der Fähigkeit, Millionen von Fragmenten gleichzeitig zu sequenzieren. Es ist kosteneffektiv pro Base für große Projekte, erfordert jedoch erhebliche bioinformatische Ressourcen für die Datenanalyse.